背景

几乎所有种类的RNA的成熟、运输、稳定性和退化等都受控于复杂的转录后调控机制。自转录起始，不同的RNA结合蛋白(RBPs)会与RNA结合，形成高阶核糖核酸蛋白(RNP)复合物，并协同作用以指导RNA的功能方向。RNP复合体的动态成分不仅为调控过程提供了特异性，而且可以通过RNP复合体重构的方式对外部信号产生高效应答的转录调节。因此，这种调控模式依赖于RBPs在RNA上的富集程度以及具有重叠靶标特异性的RBPs之间的竞争，这一点有助于通过全面分析RBPs研究转录后调控网络机制。

 

到目前为止,这种方法已经成功地应用于细胞系如HEK293，Hela，Huh-7， HL-1以及多样化的生物包括酿酒酵母，秀丽隐杆线虫，黑腹果蝇，拟南芥，恶性疟原虫，杜氏利什曼虫和鲐鱼类。

技术简介

为了全面研究蛋白质与RNA互作网络机制，将交联反应与高纯度的oligo(dT)亲和纯化反应结合，富集与含polyA尾的mRNA互作的蛋白质，利用定量蛋白质组学识别与mRNA结合的蛋白质组(Baltz, Munschauer et al. 2012)，另外还可利用二代测序技术研究mRNA转录本的蛋白质占有率。这种捕获mRNA互作组的方法可以应用在多种细胞系和模式生物，用于检测更广泛的RBPs并得到其全面结构(Kastelic and Landthaler 2017)。

 

紫外交联的方法：

 

常规的紫外线交联(cCL)利用在254nm紫外线照射来诱导核酸和蛋白质之间的共价键形成；将光激活的核糖核苷(PARs)，如4-硫代嘌呤(4SU)和6-硫鸟苷(6SG)合并成新合成的RNA，以增强交联PAR-CL)，365nm紫外线辐射会在4SU和6SG的位点上引发RNA和蛋白质之间的共价键形成。

 

这两种方法尽管作为选择的交联方式与mRNA结合，紫外线照射可能并不总是可行的选择，因为光穿透(cCL和PAR-CL)或核苷合并(PAR-CL)可以限制操作的效果。

 

为了克服这一限制，使用甲醛(FA)的化学交联可以像RIPiT-seq的protocol那样用于共价交联RNA和与其相互作用的蛋白质。最关键的是，FA交联还可以诱导蛋白质之间的共价键形成，这一特性可以用来稳定高阶的RNPs

参考文献：

Baltz, A. G., M. Munschauer, B. Schwanhausser, A. Vasile, Y. Murakawa, M. Schueler, N. Youngs, D. Penfold-Brown, K. Drew, M. Milek, E. Wyler, R. Bonneau, M. Selbach, C. Dieterich and M. Landthaler (2012).

“The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.” Mol Cell 46(5): 674-690.

Kastelic, N. and M. Landthaler (2017). “mRNA interactome capture in mammalian cells.” Methods 126: 38-43.

技术流程

    1.  mRNA interactome capture in mammalian cells

»Cell Culture and crosslinking
»Preparation of cell lysate and oligo(dT) pulldown

    1.  Downstream applications

»RNase treatment
»Protein quality control: SDS-PAGE
»Protein quality control: Western analysis
»poly(A)+ depletion control
»Mass Spectrometry

  1. Identification of RBPs in mRNA interactome capture mass spectrometry data

通过质谱分析在蛋白质组水平上检测富集的RBPs

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