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互作组 · RNA-蛋白互作

RNA pulldown 体外 RNA 下拉

想知道一段 RNA 结合了什么蛋白，最直接的办法是把它做成"诱饵"放进细胞裂解液里。RNA pulldown 用生物素标记的 RNA 探针做诱饵，结合上的蛋白被链霉亲和素磁珠带下来——已知蛋白用 WB 确认，未知蛋白用质谱筛。配套全长法与探针法两套方案，长 RNA、短 RNA、特定转录本都能覆盖。

  • 全长法 / 探针法双方案
  • lncRNA / circRNA / miRNA 通用
  • WB 验证 + MS 筛选
  • 反义链探针对照
  • 不受长度与类别限制
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2种方案全长法钓内源蛋白，探针法抓特定转录本
≥8×10⁷ 细胞组织送样量见送样表
8–12周探针制备与验证个性化，实验 + MS 8–12 周
反义对照每个实验配反义链探针对照排除非特异
01

技术简介

RNA pulldown 是体外研究 RNA 与蛋白质相互作用的关键方法。它用生物素标记的 RNA 探针作"诱饵"，放进细胞裂解液中，把与该 RNA 特异性结合的蛋白捕获下来。相比在细胞内做交联的方法，体外体系条件可控、背景干净、通量高，是验证和筛选 RNA 结合蛋白的首选方案之一。

它的适用面很广：lncRNA、circRNA、miRNA、mRNA 的特定转录本都可以做诱饵。无论你想确认一个已知结合蛋白，还是想筛出整组未知结合蛋白，都能在同一套流程里完成。

02

技术优势

特异性捕获互作蛋白

能特异性地获得一个 RNA（包括 lncRNA、circRNA、miRNA、mRNA 特定转录本）的互作蛋白，解析该 RNA 发挥功能和作用的分子机制，而不是得到一堆与这个 RNA 无关的高丰度蛋白。

两套方案覆盖全类型 RNA

配套全长法与探针法两种实验方案，实现全类型 RNA 分子捕获，消除长度限制、类别限制，以期准确获得目的基因捕获的蛋白，排除非特异性干扰。

流程简单、成功率高

不需要紫外交联、不需要 IP 级抗体，实验操作流程简单、成功率高、周期可控。对没有合适抗体的非模式物种、标签系统难以构建的样本尤其友好。

WB 与 MS 双出口

洗脱产物既可以用 Western Blot 确认特定的 RNA 结合蛋白是否与 RNA 发生相互作用，也可以用质谱（MS）筛选与 RNA 结合的未知蛋白，一条实验路线两种验证层级。

03

技术原理

技术流程是：体外转录制备带有生物素标记的 RNA 探针，随后将其与细胞质蛋白提取物混合，形成 RNA-蛋白质复合体；该复合体与链霉亲和素修饰的磁珠结合，实现与混合液中其他成分的分离；洗脱后，通过 WB 确认特定 RNA 结合蛋白，或用质谱筛选未知结合蛋白。

目前提供两种方法：

① 全长法

用全长的正义链-生物素标记探针钓取结合的蛋白，全长的反义链-生物素标记探针作为对照组。全长法是把整个基因作为探针去钓取，相当于外源基因对内源蛋白结合的捕获。适合目标 RNA 较短、或希望覆盖全部潜在结合区域的情况。

② 探针法

当基因较长（如超过 3 kb），或需要针对某个特定转录本、避开其他转录本时使用：短片段-反义链-生物素标记探针与体内正义链的靶标基因结合，钓取体内靶标基因结合的蛋白；短片段-反义链-不加生物素标记的探针作为对照组。相当于对内源靶标基因结合蛋白的捕获。

04

实验流程

1

探针制备

体外转录制备生物素标记 RNA 探针，电泳与浓度质检

2

蛋白提取

裂解细胞制备蛋白提取物，保留蛋白天然构象

3

探针-蛋白孵育

标记探针与蛋白提取物孵育，形成 RNA-蛋白复合体

4

磁珠捕获

链霉亲和素磁珠结合复合物，洗去未结合蛋白

5

洗脱与检测

洗脱获得结合蛋白，用于 WB 验证或质谱鉴定

6

对照分析

反义链 / 无标记探针对照同步进行，排除非特异结合

RNA pulldown 原理：生物素标记 RNA 探针与蛋白孵育，链霉亲和素磁珠捕获复合物后洗脱检测
RNA pulldown 原理：生物素标记探针捕获互作蛋白，磁珠分离后 WB 或 MS 检测
05

实测数据

示例 · lincRNA-p21 与 hnRNP-K 的特异性结合

这是 RNA pulldown 最经典的结果呈现方式：生物素标记的 lincRNA-p21 正义链探针（右泳道）与反义链探针（左泳道）分别与细胞核提取物孵育，链霉亲和素磁珠捕获后跑 SDS-PAGE 凝胶。hnRNP-K 被鉴定为 lincRNA-p21 特有的条带——正义链有、反义链没有，这就是特异性结合的直接证据。右侧 Western 印迹进一步确认 hnRNP-K 与 lincRNA-p21 的结合，同时以非特异性蛋白 NONO 作为对照。

RNA pulldown 结果示例：结合到 lincRNA-p21 的蛋白质 SDS-PAGE 凝胶（右泳道）与反义 RNA 对照（左泳道），hnRNP-K 被鉴定为特有条带，Western 印迹以 NONO 为非特异性对照
正义链 / 反义链探针对照 + Western 验证：特异性结合要有对照才能成立
06

样本要求

探针策略需在启动前确定：全长法还是探针法、针对哪个转录本，请提供目标 RNA 的序列与转录本信息。

样本类型要求说明
细胞≥8×10⁷ 个活细胞状态良好、无污染；组织取目标区域，避免坏死与钙化部分
细胞干体积≥80 µL
动物组织 · 心、脑、肾、肺≥300 mg新鲜组织液氮速冻后 −80 ℃ 保存，干冰运输；避免反复冻融
动物组织 · 肝、脾、胃≥300 mg
动物组织 · 皮肤、血管、软骨、骨等坚韧组织≥500 mg
植物组织≥1 g选健康幼嫩组织；70% 酒精冲洗表面后液氮速冻，干冰运输
07

应用案例

项目案例一
IF 9.4 Genome Biology · 抗病毒 lncRNA

A novel antiviral lncRNA, EDAL, shields a T309 O-GlcNAcylation site to promote EZH2 lysosomal degradation

一种新型抗病毒 lncRNA EDAL 屏蔽 T309 O-GlcNAcylation 位点以促进 EZH2 溶酶体降解

期刊：Genome Biology（IF 9.4，2024 JCR）　·　发表时间：2020 年
我司支持：RNA Pulldown等技术支持，我方团队参与共同通讯、共同一作署名。
阅读原文：doi.org/10.1186/s13059-020-02150-9

样本：小鼠神经细胞与狂犬病病毒等嗜神经病毒感染模型　·　方法：RNA pull-down、EZH2 降解检测、O-GlcNAcylation 位点分析
研究发现：华中农业大学赵凌教授团队揭示了神经系统内 lncRNA EDAL 在对抗嗜神经病毒中的抑制功能。嗜神经病毒能在神经细胞内激发 EDAL 表达；EDAL 与 EZH2 特异性结合，通过调节 EZH2 的 T309 位点 O-GlcNAcylation 修饰促进其经溶酶体途径降解，最终导致抗病毒多肽 PCP4L1 表达，抑制多种嗜神经病毒增殖。

为定位 EDAL 中负责抗病毒功能的序列区段，研究者将其划分为四个部分逐一检验对 EZH2 降解的影响。RNA pull-down 结果显示，只有 EDAL-1 能显著减少 EZH2 和 H3K27me3 水平以及狂犬病病毒增殖；在 EDAL-1 中逐步移除序列后，确定 98–153 位点之间、长度 56 个碱基的序列可能是抗病毒活性核心，把这段序列整合到其他 lncRNA 结构中同样观察到抗病毒效果。

案例二
IF 33.9 Molecular Cancer · 结直肠癌

Long noncoding RNA DLGAP1-AS2 promotes tumorigenesis and metastasis by regulating the Trim21/ELOA/LHPP axis in colorectal cancer

长链非编码 RNA DLGAP1-AS2 通过调节 Trim21/ELOA/LHPP 轴促进结直肠癌的肿瘤发生和转移

期刊：Molecular Cancer（IF 33.9，2024 JCR）　·　发表时间：2022 年
阅读原文：doi.org/10.1186/s12943-022-01675-w

样本：结直肠癌及邻近组织转录组测序、公共数据库与临床样本验证　·　方法：RNA-seq、RNA pull-down、RIP
研究发现：江南大学附属医院团队通过二代测序识别出一系列在结直肠癌中差异表达的 lncRNA，结合公共数据库与临床样本验证，挑选出肿瘤中显著上调的 DLGAP1-AS2 作为研究焦点；其高表达与患者不良预后紧密相关，并鉴定出新的优势转录本（MK336171）。

机制上，通过 RNA pull-down 和 RIP 鉴定出与 DLGAP1-AS2 互作的结合蛋白 CPSF2、CSTF3 和 ELOA：DLGAP1-AS2 促进 E3 泛素化连接酶 Trim21 与转录延伸因子 A（ELOA）之间的相互作用，增加 ELOA 的泛素化降解，从而抑制其对下游靶基因 LHPP 的转录激活，导致 AKT 信号通路活化，促进肿瘤发生发展。此外，CPSF2 与 CSTF3 与 DLGAP1-AS2 结合并共同增强其稳定性。

案例三
IF 33.9 Molecular Cancer · EB 病毒阳性 DLBCL

CircEAF2 counteracts Epstein-Barr virus-positive diffuse large B-cell lymphoma progression via miR-BART19-3p/APC/β-catenin axis

CircEAF2 通过 miR-BART19-3p/APC/β-catenin 轴对抗 Epstein-Barr 病毒阳性弥漫性大 B 细胞淋巴瘤进展

期刊：Molecular Cancer（IF 33.9，2024 JCR）　·　发表时间：2021 年
阅读原文：doi.org/10.1186/s12943-021-01458-9

样本：12 例 DLBCL 患者肿瘤样本高通量测序 + 100 例肿瘤样本 qPCR 验证 + EBV 感染 B 淋巴瘤小鼠模型　·　方法：circRNA-seq、RNA pull-down、双荧光素酶
研究发现：研究在 12 例 DLBCL 患者肿瘤样本中筛选 circRNA，并在 100 例样本中验证表达与临床特征的关系，发现新 circRNA circEAF2 在 EBV 阳性 DLBCL 中表达降低，与 EBV 感染及疾病进展呈负相关；过表达 circEAF2 促进细胞凋亡并增强对表柔比星的敏感性。

机制上，RNA pull-down 实验发现 circEAF2 特异性靶向 EBV 编码的 miR-BART19-3p，上调 APC 蛋白、抑制 β-catenin 表达，使 Wnt 信号通路失活，进而抑制 EBV 阳性 DLBCL 细胞增殖。小鼠模型中，circEAF2 过表达的移植瘤 Ki-67 阳性细胞减少、凋亡增加、生长减缓。

08

常见问题

全长法和探针法怎么选？
看两个因素：RNA 长度和是否需要区分转录本。RNA 较短（几 kb 以内）、想覆盖全部潜在结合区域，用全长法；基因较长（超过 3 kb）或需要针对某个特定转录本、避开其他共享外显子的转录本，用探针法。拿不准时把序列发来，我们给出建议。
需要多少细胞？组织样本可以吗？
按送样规范，细胞 ≥8×10⁷（干体积 ≥80 µL），动物组织心脑肾肺、肝脾胃 ≥300 mg，坚韧组织 ≥500 mg，植物 ≥1 g。组织样本需先做蛋白提取，某些组织的细胞外基质和脂肪会影响提取效率，送样量按上限准备更稳妥。
探针一定要生物素标记吗？
是。生物素-链霉亲和素体系亲和力极强（Kd 约 10⁻¹⁴ M），且磁珠偶联的链霉亲和素背景低，是 RNA pulldown 的标准配置。对照组用反义链-生物素标记探针（全长法）或无生物素标记的同序列探针（探针法），与实验组严格平行。
项目周期多久？
探针制备与验证为个性化周期，视探针长度、GC 含量与二级结构难度而定；RNA pulldown 与质控检测实验 + MS 质谱（不含重复、不含探针）为 8–12 周。若目标 RNA 需要先确认序列或转录本结构，请在项目启动时一并说明。
可以只做 WB 验证、不做质谱吗？
可以。若已有明确的候选结合蛋白，只需 WB 确认，周期和费用都明显低于全套 MS。建议先提供候选蛋白名称与抗体信息，我们评估抗体可用性后给出最简方案。
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