iRIP-seq 改良 RNA 免疫沉淀
RIP-seq 操作简单，但抓到的 RNA 没经过酶切片段化，片段偏长，说不清 RBP 究竟结合在哪个位点。iRIP-seq 是瑞兴生物自主开发的技术：把 CLIP 的紫外交联和 MNase 酶切搬进 RIP，再套用 CLIP-seq 的分析流程——既拿到 peaks 和 Motif，又不用做 CLIP 那套切胶纯化。
技术简介
RIP-seq 研究的是自然状态下最原始的 RBP 和 RNA 互作状态：用抗体把 RBP 拉下来，测它带着的 RNA。好处是捕获到的 RNA 未经酶切片段化、片段较长，也无需 RBP 切胶纯化步骤，操作流程简单、成功率高。代价是——得不到 RBP 直接结合的 RNA 位点。
iRIP-seq（Improved RIP-seq）是瑞兴生物自主开发用于研究 RBP 的新技术：把 CLIP-seq 中的紫外交联（UV-crosslinking）和 MNase 酶切实验加入传统 RIP 技术，同时用 CLIP-seq 数据分析流程获得 RBP 结合的 peaks 和 Motif 信息。该技术既准确识别了 RNA 结合位点，又保留了 RIP-seq 的简单性。
技术优势
高效且特异
紫外交联共价固定互作位点，配合更严格的离子去污剂和高盐漂洗条件，实验过程中产生的噪音更小，信噪比更高，能够对目标生物系统中的 RBP 进行精准分析。
已知互作可验证，新 RBP 可发现
不仅可以成功检测到已知的 RNA 与蛋白间的相互作用，同时也能发现新的 RNA 结合蛋白以及它们参与的相互作用网络，为解析基因表达调控提供新线索。
同时拿到位点与 Motif
用 CLIP-seq 分析流程获得 RBP 结合的 peaks 和 Motif 信息，既能定位结合位点，又能反推 RBP 的识别基序，为研究该蛋白调控哪些 RNA 提供直接依据。
保留 RIP 的简便性
无需 CLIP 那套 RBP 切胶纯化步骤，MNase 酶切钙离子依赖、可用 EDTA 等螯合剂随时终止，反应可控；改进的文库构建方法能成功构建 UV 交联位点中断的 RT 产物文库。
技术原理
iRIP-seq 的核心是在 RIP 的基础上补上两步 CLIP 的关键操作。第一步是 UV 交联：用紫外照射让 RBP 与它结合的 RNA 形成共价键，把瞬时、动态的互作固定下来，后续洗涤再剧烈也不会把真实结合的 RNA 洗掉。
第二步是 MNase 酶切片段化 RNA：MNase 是钙离子依赖的核酸酶，可用 EDTA 等螯合剂随时终止反应，酶切程度可控。片段化后的 RNA 长度适合测序，免疫沉淀后即可建库。
第三步是文库构建：通过成功构建 UV 交联位点中断的 RT 产物文库，使 RBP-RNA 互作位点的检测更为精准和高效。数据分析套用 CLIP-seq 流程，输出结合位点（peaks）与 Motif。
实验流程
UV 交联
活细胞紫外照射，共价键固定 RBP-RNA 互作位点
细胞裂解
温和裂解，保持 RBP-RNA 复合物完整
MNase 酶切
钙离子依赖酶切片段化 RNA，EDTA 可随时终止
免疫沉淀
靶蛋白抗体捕获 RBP-RNA 复合物，严格洗涤降噪
RNA 提取
回收与靶蛋白结合的 RNA 片段
文库构建与测序
构建交联位点中断的 RT 产物文库，上机测序
样本要求
IP 级抗体是项目启动的前提，请随样本一并提供抗体信息。
| 样本类型 | 要求 | 说明 |
|---|---|---|
| 抗体 | IP 级 ≥40 µg 或按说明书（一般 ≥40 µL） | 需能识别天然构象靶蛋白；建议提供 IP / IF 数据佐证 |
| 细胞 | ≥8×10⁷ 个 | 活细胞状态良好、无污染；组织取目标区域，避免坏死与钙化部分 |
| 细胞干体积 | ≥80 µL | |
| 动物组织 · 心、脑、肾、肺 | ≥300 mg | 新鲜组织液氮速冻后 −80 ℃ 保存，干冰运输；避免反复冻融 |
| 动物组织 · 肝、脾、胃 | ≥300 mg | |
| 动物组织 · 皮肤、血管、软骨、骨等坚韧组织 | ≥500 mg | |
| 植物组织 | ≥1 g | 选健康幼嫩组织；70% 酒精冲洗表面后液氮速冻，干冰运输 |
分析内容
标准分析 STANDARD
- 数据质控与文库评估MultiQC 汇总；碱基质量、GC 含量、有效长度、cDNA 文库 PCR 重复率
- 比对与去冗余unique / multiple、splice / nonsplice、sense / antisense 分类统计，rmdup 后进入后续分析
- 基因组分布与覆盖度5′UTR / 3′UTR / CDS / 非编码外显子 / 内含子 / 基因间区占比；转录单元与基因体各切 100 bin 的覆盖曲线
- TSS / TTS 与样本关系reads 在 TSS、TTS、起始与终止密码子附近的分布；样本相关性热图与聚类
- 结合峰识别与统计ABLIRC 与 Piranha 双策略，以 Input 为背景；输出峰数、峰内 reads 数、关联基因数
- 峰宽度、峰分布与重叠分析峰长度直方图与基因组功能区域注释；两次重复间的峰重叠 Venn，再取 ABLIRC 与 Piranha 的交集
- Motif 富集峰内序列基序富集，反推 RBP 识别特征
- 峰相关基因富集GO 三类（BP / CC / MF）与 KEGG 通路，取显著条目展示
高级分析 ADVANCED
- 组间差异结合分组比较结合强度，定位状态改变的关键位点
- 与 RNA-seq 联合结合位点 × 表达量变化，区分直接与间接调控
- 交联位点精修结合 UV 交联与 MNase 消化信息收紧结合坐标
- RNA 修饰关联结合位点与 m6A 等修饰位点叠合，看修饰对结合的依赖
- 多 RBP 整合多个 RBP 图谱叠加，解析协同与竞争
应用案例
The FOXN3-NEAT1-SIN3A repressor complex promotes progression of hormonally responsive breast cancer
FOXN3-NEAT1-SIN3A 抑制复合物促进激素反应性乳腺癌的进展
期刊：Journal of Clinical Investigation（IF 13.6，2024 JCR） · 发表时间：2017 年
阅读原文：doi.org/10.1172/jci94233
样本与方法：MCF-7 乳腺癌细胞；改良 RNA 免疫沉淀偶联高通量测序（iRIP-seq）、ChIP-seq、CHART-seq。
研究发现：尚永丰院士团队报道了转录因子 FOXN3 在乳腺癌转移中的作用及机制。在 MCF-7 中采用 iRIP-seq 鉴定了能够与 FOXN3 结合的 RNA，经验证确定 FOXN3 与 SIN3A 复合体的相互作用需要一个受雌激素诱导的长链非编码 RNA NEAT1 的参与。ChIP-seq 结果与 CHART-seq 数据联合分析证明，FOXN3/NEAT1/SIN3A 复合体转录抑制包括 GATA3 和 TJP1 在内的一系列参与乳腺癌转移的重要基因。
MEX3B inhibits collagen production in eosinophilic nasal polyps by downregulating epithelial cell TGFBR3 mRNA stability
MEX3B 通过下调上皮细胞 TGFBR3 mRNA 稳定性抑制嗜酸性鼻息肉中胶原蛋白的产生
期刊：JCI Insight（IF 6.1，2024 JCR） · 发表时间：2023 年（期刊封面文章）
阅读原文：doi.org/10.1172/jci.insight.159058
样本与方法：嗜酸性鼻息肉上皮组织；MEX3B 敲低与过表达后 RNA-Seq + iRIP-Seq 联合分析。
研究发现：华中科技大学同济医学院附属同济医院刘争教授团队为探讨 MEX3B 作为 RBP 在气道上皮细胞中的直接下游靶点，将 MEX3B 敲低和过表达后进行 RNA-Seq 和 iRIP-Seq，共得到 7 个重叠基因，重叠的 mRNA 被认为是被 MEX3B 直接结合并调控的 mRNA，其中 TGFBR3 尤为引人关注。TGF-βR3 可高亲和力结合并增强 TGF-β2 通路功能；在非嗜酸粒细胞性鼻息肉中 TGF-βR3 表达降低，引起 TGF-β2 通路功能减弱、胶原家族相关基因表达减少，促进组织水肿形成。
The m6A Reader IGF2BP2 Regulates Macrophage Phenotypic Activation and Inflammatory Diseases by Stabilizing TSC1 and PPARγ
m6A 阅读器 IGF2BP2 通过稳定 TSC1 和 PPARγ 调节巨噬细胞表型激活和炎症疾病
期刊：Advanced Science（IF 14.1，2024 JCR） · 发表时间：2021 年
阅读原文：doi.org/10.1002/advs.202100209
样本与方法：巨噬细胞模型；iRIP-seq 结合 m6A 修饰分析与功能实验。
研究发现：山东大学基础医学院李景新教授课题组利用 iRIP-seq 发现巨噬细胞中 IGF2BP2 可结合 Kcnn4、Arg1、Hist1h1b、Hist1h4c、Cd74、Ak2、H2-Eb1、Csf1r、PPARγ 等多个在巨噬细胞激活及极化过程中发挥重要功能基因的 mRNA，参与 m6A 修饰调控 TSC1 和 PPARγ 的表达。IGF2BP2 通过 TSC1-mTORC1 通路和 PPARγ 介导的脂肪酸代谢使巨噬细胞从促炎表型向消炎表型倾斜。
Inhibition of the m6A reader IGF2BP2 as a strategy against T-cell acute lymphoblastic leukemia
抑制 m6A 阅读器 IGF2BP2 作为对抗 T 细胞急性淋巴细胞白血病的策略
期刊：Leukemia（IF 13.4，2024 JCR） · 发表时间：2022 年
阅读原文：doi.org/10.1038/s41375-022-01651-9
样本与方法：Jurkat T-ALL 细胞；iRIP-seq 探索 IGF2BP2 转录组范围结合谱 + RNA-seq。
研究发现：李景新教授课题组利用 iRIP-seq 探索了 IGF2BP2 在 Jurkat 细胞中的转录组范围的结合谱：大多数 IGF2BP2 结合的 reads 位于 mRNA 中，并且在 CDS 中高度富集。对 IGF2BP2 上调或下调的 Jurkat 细胞进行 RNA-seq，结合 iRIP-seq 数据鉴定出 2,309 个调控基因，大量基因（NOTCH1、NKX2-1、BCL11B、RUNX1、FBXW7、STAT5B、DNM2、AKT1/2、MTOR、ABL1、DNMT3A 和 RPL11）与 T-ALL 发病相关。IGF2BP2 作为 m6A 阅读器增加 NOTCH1 的稳定性，维持和增加转化 T-ALL 细胞的生长；IGF2BP2 活性抑制剂 JX5 能有效抑制 NOTCH1 的激活和 T-ALL 的生长。
A-to-I RNA editing in bacteria increases pathogenicity and tolerance against oxidative stress
细菌中的 A-to-I RNA 编辑增加了对氧化应激的致病性和耐受性
期刊：PLoS Pathogens（IF 4.9，2024 JCR） · 发表时间：2020 年
阅读原文：doi.org/10.1371/journal.ppat.1008740
样本与方法：稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola，Xoc）；iRIP-seq 数据 + 自研 Python 脚本识别 A-to-I 编辑事件。
研究发现：上海交通大学农业与生物学院朱勃 / 陈功友联合团队揭示了原核细菌通过 A-to-I 的 RNA 编辑适应环境变化的新机制。研究团队通过 iRIP-seq 数据对 Xoc 在氧化应激下的 A-to-I 编辑事件进行识别和分析，发现 A-to-I 编辑在氧化应激胁迫下将鞭毛蛋白 FliC 第 128 位氨基酸由丝氨酸（S）变为脯氨酸（P），导致鞭毛丝结构改变。这种转录后编辑可以通过增加生物膜的形成来提高氧化应激耐受性和在水稻上的毒性。
常见问题
iRIP-seq 和 eCLIP-seq 怎么选？
为什么用 MNase 而不是 RNase？
没有 IP 抗体可以换成过表达标签蛋白吗？
需要多少生物学重复？测序量多少？
项目周期多久？
能研究 RNA 修饰与 RBP 的关系吗？
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