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互作组 · DNA-蛋白互作

DNA pulldown 体外 DNA 下拉

promoter 上有没有转录因子结合，光靠预测不算数。DNA pulldown 把感兴趣的 DNA 序列做成生物素标记探针，直接放进蛋白提取物里"钓"结合蛋白——钓到了，就是直接证据。最常见的用法是验证启动子与转录因子的互作，也可以用质谱筛出结合该 DNA 元件的未知蛋白。

  • 启动子-转录因子验证
  • 探针长度设计范围广
  • 蛋白保持天然构象
  • 特异性强、假阳性率低
  • 真核 / 原核生物均可
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探针长度灵活几十 bp 到数 kb 均可，按元件设计
≥8×10⁷ 细胞组织送样量见送样表
8–12周探针制备与验证个性化，实验 + MS 8–12 周
低丰度可富集可捕获表达量较低的结合蛋白
01

技术简介

DNA pulldown 是体外条件下研究目标 DNA 片段与蛋白质相互作用的技术。它以感兴趣的 DNA 序列为中心，寻找与该序列结合的蛋白质，最常见的应用是验证启动子与转录因子的互作情况。

做法是：在体外制备带有生物素标记的 DNA 探针，与链霉亲和素磁珠结合，再将 DNA 探针-磁珠与细胞裂解液孵育，DNA 结合蛋白便一起吸附在磁珠上；洗涤掉未结合的蛋白后，用洗脱液将 DNA 结合蛋白从磁珠上洗脱下来。得到的 DNA-蛋白复合物既可以用 Western Blot 检测已知蛋白，也可以用质谱鉴定未知蛋白。

02

技术优势

探针长度设计范围广

从几十 bp 的核心元件到数 kb 的启动子区段都可以设计，能按研究问题自由截取目标区域，也可以做连续截短体定位关键结合位点。

蛋白保持天然构象

蛋白提取自新鲜组织和细胞，保留天然折叠状态与翻译后修饰，结合活性更接近体内真实情况，不会因为重组表达缺失修饰而失去结合能力。

特异性强、假阳性率低

配合同序列突变探针或无关序列探针作对照，只有真正依赖该 DNA 序列的蛋白才会被留下，能有效区分"结合 DNA"与"粘在磁珠上"。

适用面广、通量高

适用于真核生物和原核生物；实验周期短、通量高、灵敏度高，能富集低丰度结合蛋白，并与下游 WB、MS 等检测技术兼容。

03

技术应用

1. 基因调控研究

研究转录因子与基因启动子的结合，揭示基因调控机制和转录调控网络，对理解基因表达调控、发育过程和疾病发展具有重要意义。

2. 信号转导通路研究

研究信号转导通路中关键蛋白质与 DNA 的相互作用，如激活因子、抑制因子等，有助于阐明信号转导机制和调控网络。

3. 疾病机制研究

研究与疾病相关的基因突变位点或调控元件的结合蛋白，帮助揭示疾病的发生和发展机制，为疾病诊断和治疗提供理论依据。

4. 药物开发与筛选

筛选与特定 DNA 序列结合的小分子化合物或药物，帮助寻找新的药物靶点和开发潜在的治疗方法。

5. 比较基因组学研究

比较不同物种、不同组织或不同条件下的 DNA-蛋白质相互作用，帮助理解基因组的进化、组织特异性和环境适应等方面的变化。

04

实验流程

1

DNA 探针制备

合成或 PCR 扩增目标 DNA 序列，末端标记生物素并质检

2

磁珠捕获与孵育

链霉亲和素磁珠捕获 DNA 探针形成探针-磁珠，再与细胞裂解液孵育捕获蛋白

3

蛋白质检测分析

洗脱获得 DNA 结合蛋白，Western Blot 验证或质谱鉴定

DNA pulldown 流程：生物素标记 DNA 探针与链霉亲和素磁珠结合，与细胞裂解液孵育捕获结合蛋白，洗脱后 WB 或质谱检测
DNA pulldown 流程：探针制备 → 磁珠捕获与孵育 → WB / MS 检测
对照设计：① 同序列突变探针对照（突变预测的关键结合位点）——用于证明结合依赖该段序列；② 无关序列探针对照（同等长度、GC 含量相近）——用于排除长度与电荷效应；③ 空白磁珠对照——扣除磁珠本身吸附的蛋白。三组对照并行，结论才站得住。
05

样本要求

目标 DNA 序列需在启动前确定，包括参考基因组版本、起止坐标或序列文件。

样本类型要求说明
细胞≥8×10⁷ 个活细胞状态良好、无污染；组织取目标区域，避免坏死与钙化部分
细胞干体积≥80 µL
动物组织 · 心、脑、肾、肺≥300 mg新鲜组织液氮速冻后 −80 ℃ 保存，干冰运输；避免反复冻融
动物组织 · 肝、脾、胃≥300 mg
动物组织 · 皮肤、血管、软骨、骨等坚韧组织≥500 mg
植物组织≥1 g选健康幼嫩组织；70% 酒精冲洗表面后液氮速冻，干冰运输
06

应用案例

案例一
IF 4.3 Front Cell Dev Biol · 肌肉再生

Lnc-GD2H Promotes Proliferation by Forming a Feedback Loop With c-Myc and Enhances Differentiation Through Interacting With NACA to Upregulate Myog in C2C12 Myoblasts

Lnc-GD2H 通过与 c-Myc 形成反馈环促进增殖，并通过与 NACA 互作上调 Myog 增强 C2C12 成肌细胞分化

期刊：Frontiers in Cell and Developmental Biology（IF 4.3，2024 JCR）　·　发表时间：2021 年
阅读原文：doi.org/10.3389/fcell.2021.671857

样本与方法：C2C12 成肌细胞；双荧光素酶、ChIP、DNA pull-down、RNA pull-down、RIP 等实验。
研究发现：研究揭示了 lncRNA lnc-GD2H 在肌肉再生中的作用：在成肌细胞增殖过程中，c-Myc 蛋白与 lnc-GD2H 启动子结合并调节其转录，促进成肌细胞增殖，形成反馈环；在分化过程中，lnc-GD2H 与成肌细胞分化相关蛋白 NACA 相互作用，抑制 NACA 在 Myog 启动子的富集，减轻 NACA 对 Myog 的抑制作用，从而促进 Myog 表达和成肌细胞分化。

案例二
IF 3.9 Scientific Reports · 家蚕丝蛋白

New insights into the proteins interacting with the promoters of silkworm fibroin genes

家蚕丝素蛋白基因启动子互作蛋白研究的新见解

期刊：Scientific Reports（IF 3.9，2024 JCR）　·　发表时间：2021 年
阅读原文：doi.org/10.1038/s41598-021-95400-0

样本与方法：家蚕丝腺组织；DNA pull-down 结合质谱分析。
研究发现：研究报道了家蚕中调控丝素蛋白编码基因所必需的启动子互作蛋白（PIP），包括丝素重链（Fibre H）、丝素轻链（FiBL）和一个 25 kD 的多肽蛋白（P25）。作者通过 DNA pull-down 结合质谱分析鉴定与 FibH、FiBL 和 P25 启动子区域相互作用的蛋白质，首次提供了与丝素基因启动子互作蛋白质的深入图谱，有助于更好地理解丝蛋白的合成调控。

07

常见问题

DNA pulldown 和 EMSA、ChIP 怎么配合？
三者回答的问题不同：DNA pulldown 用 DNA 序列钓蛋白，回答"这段 DNA 能结合哪些蛋白"，适合筛选与验证；EMSA 在凝胶上直接看 DNA-蛋白复合物条带，适合快速确认结合是否存在；ChIP 在细胞内用抗体拉蛋白看它结合哪些基因组区域，回答"这个蛋白在体内结合哪里"。典型组合是 pulldown 筛候选 → EMSA 快速确认 → ChIP 验证体内结合。
探针要多长？合成还是 PCR 扩增？
核心元件（几十 bp）可直接合成；启动子区段（数百 bp 到数 kb）建议 PCR 扩增后标记。长度没有硬性上限，但过长的探针折叠概率增加、捕获效率下降，一般建议单条探针控制在 1 kb 以内，长区段可拆分设计。我们会根据序列特征给出建议。
为什么必须做突变体探针对照？
因为生物素-链霉亲和素体系很强，一些蛋白可能通过电荷或疏水作用"粘"在探针上，而不是真正识别序列。用突变掉预测结合位点的同序列探针对照，能区分"序列特异性结合"与"非特异吸附"——两组都出现的蛋白，不能认定为该元件的结合蛋白。
原核生物可以做吗？
可以。本方法适用于真核生物和原核生物，原核系统的蛋白提取甚至更简单。需注意原核生物没有组蛋白，DNA 呈裸露状态，探针设计时不必考虑核小体占据，但也要留意细菌 DNA 结合蛋白（如 HU、IHF）可能带来的背景。
项目周期多久？
探针制备与验证为个性化周期（含核蛋白提取环节），DNA pulldown 与质控检测实验 + MS 质谱为 8–12 周。若只需 WB 验证已知蛋白、不做质谱，周期可明显缩短。
可以提供蛋白样本而不是细胞吗？
可以。若有纯化或部分纯化的蛋白，可直接与探针孵育做体外结合，能排除细胞内其他蛋白的干扰，更直接地确认二元互作。请提供蛋白浓度、纯度与缓冲液成分信息，我们评估兼容性。
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