DIA 定量蛋白质组学（数据非依赖性采集，全景式蛋白定量）

DIA 定量蛋白质组学

传统 DDA 采集有个绕不开的毛病：谁信号强就先采谁。高丰度肽段被反复选中，低丰度蛋白永远排不上队，数据里就留下一堆缺失值。DIA 换了规则——按 m/z 窗口全采，不挑。每个窗口内的所有母离子都碎裂、都记录，事后靠算法回溯提取。代价是数据量大、依赖谱图库，换来的是定量准、重复性好、缺失值少、数据可回溯。

全景扫描无遗漏

低丰度不丢

缺失值更少

数据可回溯

适配大队列

样本类型	常规送样量	最低送样量	说明
蛋白溶液 / 蛋白量	≥50 µg	≥30 µg（仅做蛋白鉴定 ≥10 µg）	浓度不低于 0.1 µg/µL；澄清、无色、不粘稠；−20 ℃ 保存，冰袋送样
组织	≥50 mg	5–10 mg	液氮速冻后 −80 ℃ 保存，干冰寄送；脂肪、骨、皮肤等特殊组织加量
细胞	≥1×10⁶	≥1×10⁵	细胞沉淀干体积 ≥20 µL；PBS 洗两遍后离心去上清，液氮速冻
血浆 / 血清	≥100 µL	≥50 µL	避免溶血；采血后尽快分离，最晚 48 h 内完成，防止蛋白降解
外泌体	≥2×10⁹ 颗粒（NTA）	≥1×10⁹ 颗粒	相当于 BCA 蛋白总量 40 µg / 20 µg；分离后加 100 µL PBS 保存，不超过 200 µL
FFPE 切片	10 片以上	—	每片厚 10 µm、组织面积 1 cm²（约 10 µg/片）
IP Beads	正常 IP 后的干 Beads	—	PBS 洗三遍后去掉上清保留干 Beads，取 3/4 送样，−20 ℃ 冰袋寄送

样本类型

常规送样量

最低送样量

说明

蛋白溶液 / 蛋白量

≥50 µg

≥30 µg（仅做蛋白鉴定 ≥10 µg）

浓度不低于 0.1 µg/µL；澄清、无色、不粘稠；−20 ℃ 保存，冰袋送样

组织

≥50 mg

5–10 mg

液氮速冻后 −80 ℃ 保存，干冰寄送；脂肪、骨、皮肤等特殊组织加量

细胞

≥1×10⁶

≥1×10⁵

细胞沉淀干体积 ≥20 µL；PBS 洗两遍后离心去上清，液氮速冻

血浆 / 血清

≥100 µL

≥50 µL

避免溶血；采血后尽快分离，最晚 48 h 内完成，防止蛋白降解

外泌体

≥2×10⁹ 颗粒（NTA）

≥1×10⁹ 颗粒

相当于 BCA 蛋白总量 40 µg / 20 µg；分离后加 100 µL PBS 保存，不超过 200 µL

FFPE 切片

10 片以上

—

每片厚 10 µm、组织面积 1 cm²（约 10 µg/片）

IP Beads

正常 IP 后的干 Beads

—

PBS 洗三遍后去掉上清保留干 Beads，取 3/4 送样，−20 ℃ 冰袋寄送

案例一

IF 24.9 Cancer Communications · 肿瘤进展

Proteomics profiling of colorectal cancer progression identifies PLOD2 as a potential therapeutic target

结直肠癌进展的蛋白质组学分析鉴定 PLOD2 为潜在治疗靶点

期刊：Cancer Communications（IF 24.9，2024 JCR）　·　发表时间：2022 年（42 卷 2 期，164–169）　·　阅读原文：doi.org/10.1002/cac2.12240

研究设计：西湖大学与浙江大学医学院等单位的研究者，把压力循环技术（PCT）与DIA 质谱结合，对结直肠癌肿瘤组织做蛋白质组学分析，刻画与结直肠癌发生、进展相关的蛋白质组动态。样本覆盖正常结肠、增生性息肉、腺瘤与癌四个阶段。

核心结果：比较不同临床分期肿瘤与正常结肠组织，鉴定出 928 种差异表达蛋白，主要与氧化磷酸化相关。无监督聚类确定了 6 种有生物学意义的蛋白表达模式；聚焦在进展阶段持续上调的蛋白后，发现 PLOD2 是上调最多的蛋白，且在癌前与癌变样本中始终显著上调，随后用 PRM 靶向蛋白组、Western Blot 与免疫组化三重验证。结合体外细胞实验与体内动物模型，证明 PLOD2 促进肿瘤生长、抵抗细胞坏死，并参与蛋白合成、代谢与 mRNA 翻译。

这个案例的设计值得学：它覆盖了正常→增生→腺瘤→癌的完整进展链条，而不是简单的“癌 vs 癌旁”。这种梯度设计让“哪个蛋白是随进展持续上调”变得可判断——PLOD2 之所以突出，正是因为它在这个梯度上单调上升。如果你的课题能拿到不同分期的样本，建议按这个方式设计分组。

结直肠癌进展的 DIA 蛋白组研究：样本分组与实验流程、差异蛋白表达热图与功能注释、蛋白表达模式聚类、PLOD2 的 PRM 与 WB/IHC 验证 — 从四阶段样本到 PLOD2 的多重验证（A–H）

单细胞多组学

空间组学

三代测序

转录组与功能基因组

表观遗传组

互作组

蛋白组

代谢组

微生物组

细胞分子实验

DIA 定量蛋白质组学

技术简介

技术原理

技术流程

样本制备

蛋白提取与酶解

DIA 质谱检测

谱图库构建

数据解析与定量

统计与功能分析

样本要求

应用案例

Proteomics profiling of colorectal cancer progression identifies PLOD2 as a potential therapeutic target

应用案例二

Noninvasive proteomic biomarkers for alcohol-related liver disease

应用案例三

The mouse multi-organ proteome from infancy to adulthood

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