技术简介
18S rDNA 存在于所有真核生物，序列由保守区—高变区—保守区串联构成，共 9 个高变区（V1–V9；其中 V6 在真核中相对保守）。保守区在真核各门类之间高度一致，且与细菌 16S 存在差别，因此可以在上面设计真核通用引物；高变区则承担区分任务。同一个基因既"扩得到"又"分得开"，这就是它成为真核微生物宏条形码（metabarcoding）首选标记的原因。
为什么不测全长：主流 Illumina 平台双端 300 bp 无法通读约 1,800 bp，所以常规做法是扩增 1–2 个高变区。近全长（>1,700 bp）主要用于系统发育与物种界定，通常用 Sanger 或长读长平台完成。
三个标记怎么分工：16S 只看细菌和古菌；ITS 变异更强、适合真菌种级鉴定但类群覆盖窄；18S 是唯一能一次性把"原生生物 + 真菌 + 微型后生动物"都覆盖的通用标记。研究真核微生物组，18S 是主干，ITS 常常作为真菌部分的补充，两者并行能显著提高覆盖。
技术优势
覆盖最广的真核通用标记
光合藻类、异养鞭毛虫、纤毛虫、变形虫、真菌、线虫和小型后生动物，可以在同一次测序里一起看到。做"群落里都有谁"这类问题时，没有第二个标记能替代。
多拷贝，低丰度类群也抓得住
18S 在基因组里多拷贝，配合 PCR 放大，微生物量很低的样本（如深水、空气滤膜）也能建库成功。
专用数据库，注释有据可依
原生生物方向有 PR2（由各类群专家手工注释、含环境进化枝），广覆盖方向有 SILVA；真菌部分可参考 UNITE，新序列还能用进化放置方法辅助定位。
耐降解 DNA 的短片段方案
V9 区扩增子仅约 130 bp，对片段化、部分降解的 DNA 更友好，因此成为沉积物古 DNA（sedaDNA）与环境 eDNA 监测的常用选择。
可以和 16S、ITS 同批上机
同一份 DNA 分出不同标记分别建库，一次采样拿到原核 + 真核 + 真菌三套群落数据，避免重复取材带来的偏差。
免培养，覆盖不可培养类群
绝大多数环境真核微生物无法在实验室培养，宏条形码绕开了这一步，直接读取环境里的 DNA。
技术流程
采样
水体过滤、土壤／沉积物、肠道内容物、宿主组织表面等。
DNA 提取
珠磨法裂解，去除腐殖酸等 PCR 抑制物。
质检
荧光定量 + 凝胶查完整性。
区段选择
按目标类群定 V4 或 V9，必要时双区段并行。
PCR 与建库
带 barcode 的融合引物，高保真酶，退火温度优化。
纯化定量
磁珠纯化、Qubit 定量、等摩尔混池。
测序
V4 常用 2×300；V9 通量需求大时走 2×150。
分析与过滤
去噪注释后剔除后生动物、植物、线粒体与质体序列。
常用引物与区段怎么选
| 区段 | 常用引物对 | 产物长度 | 适用与注意 |
|---|---|---|---|
| V4 | TAReuk454FWD1 / TAReukREV3 | 约 380 bp | 真核通用、最主流；Tara Oceans 与 Ocean Sampling Day 的标准标记。反向引物 3′ 端简并碱基会影响读长与相对丰度，已有改用无简并版本 V4r 的建议 |
| V4 | 528F / 706R | 约 250–350 bp | 原生生物／纤毛虫多样性常用；对部分类群存在引物偏向 |
| V9 | 1380F / 1510R | 约 130 bp | EMP 推荐，海洋与 eDNA 监测首选；短片段耐降解 DNA，适合沉积物古 DNA，但分辨力低于 V4 |
| 近全长 | NS1 / NS8 | 约 1.8 kb | 物种界定与系统发育；需 Sanger 或长读长平台 |
送样要求
真核微生物样本的一个共同难点是宿主／大型生物 DNA 占比高。人的皮肤细胞、植物组织、动物宿主都会扩出 18S，挤占有效深度。低生物量样本务必提前说明。
| 样本类型 | 送样量建议 | 处理与保存 | 提示 |
|---|---|---|---|
| 水体 海水 / 淡水 | 过滤后滤膜 1–3 张 | 0.22 µm 或分级滤膜，记录滤水量；−80 ℃ | 浑浊水体分级过滤可分开粒级，信息量更大 |
| 土壤 / 沉积物 | ≥5 g | 过筛去根系与石块；−80 ℃ 或干冰 | 腐殖酸抑制明显，提取端要做去除 |
| 肠道内容物 / 粪便 | ≥200 mg | 无菌管，液氮速冻后 −80 ℃ | 真核组分占比通常远低于细菌，需评估深度 |
| 宿主组织 / 表面擦拭 | 个案评估 | −80 ℃／干冰，尽量去除宿主组织本体 | 宿主 18S 可用 blocking primer 抑制 |
| 已提取 DNA | 总量 ≥30–50 ng，浓度 ≥5–20 ng/µL | −20 ℃ 或 −80 ℃，干冰运输 | OD260/280 在 1.8–2.0；注明提取试剂盒 |
实际要求以最新版本送样规范和项目方案为准。
文献案例
| 期刊 / 年份 | 研究 | 与 18S 相关的要点 | DOI |
|---|---|---|---|
| Science 2015 |
真光层海洋真核浮游生物多样性 de Vargas C, et al. |
Tara Oceans 全球航次，分粒径过滤后用 18S rRNA 基因 V9 区宏条形码测序，一次性刻画了从光合藻类到异养原生生物再到微型后生动物的真核浮游生物群落，揭示出大量此前未被描述的系统发育新谱系，并指出异养类群的多样性长期被低估。 | 10.1126/science.1261605 |
| Science of the Total Environment 2024 |
亚热带河流不同粒径真核微生物群落的 V4 与 V9 区比较 Zhang, et al. |
沿自然—人为干扰梯度比较 5 个粒级。结论：V9 检出的类群范围更广，对 Archamoebae、Heterolobosea、Microsporidia 以及 Haptophyta、Florideophycidae、Bangiales 等藻类更有效；V4 在 <3 µm 微型类群及科／属级鉴定上优于 V9（如 Labyrinthulomycetes）。同时提示两种标记都可能存在误分类，需要谨慎解读。 | 10.1016/j.scitotenv.2024.175972 |
常见问题
18S、ITS 和 16S 我到底该做哪个？
V4 和 V9 哪个更好？
结果里的 read 数能不能当"菌的多少"？
样本里宿主／植物序列太多怎么办？
能鉴定到种吗？
注释用 PR2 还是 SILVA？
样本需要多少重复？
想同时看细菌和真核，要送两份样本吗？
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