01
技术简介
Visium HD 是 10x Genomics 开发的高分辨率空间转录组测序技术，兼容 FFPE 和 新鲜冰冻（FF） 样本，实现单细胞水平（2×2 µm 条形码方块）的全转录组基因表达分析，且组织覆盖无间隙。
空间转录组要解决的其实是一件事：基因表达量这个数字，原本是丢掉了位置的。Visium HD 的做法是在玻片上铺一层带坐标的"抓手"——约 1100 万个 2×2 µm 的条形码方块连续排满整个捕获区域。组织切片贴上去之后，每个位置抓到的转录本都带着自己的空间条形码，测序之后再把位置还原回去，就得到了一张有坐标的表达图。
它和常规 Visium 最大的差别就在"抓手"的密度。常规 Visium 每个检测点 55 µm，一个点里往往混着 1–10 个细胞，看到的是混合信号；Visium HD 换成 2×2 µm 的连续方块，且方块之间没有间隙，理论上不存在"组织上有细胞却没被覆盖"的空洞。
| 对比项 | 常规 Visium | Visium HD |
|---|
| 捕获单元 | 55 µm 检测点，一个点通常覆盖 1–10 个细胞 | 2×2 µm 条形码方块 |
| 组织覆盖 | 点与点之间有间隙 | 连续排列、无间隙 |
| 空间尺度 | 多细胞混合信号 | 单细胞尺度 |
| 分析粒度 | 按检测点统计 | 2 µm 原始数据；8×8 µm bin 为推荐分析起点 |
02
技术优势
优势 1
超高空间分辨率
通过 2×2 µm 的连续寡核苷酸阵列，结合 Visium CytAssist 仪器的探针捕获技术，限制转录本扩散，实现精确转录本定位。组织切片放在 CytAssist 里对齐后再捕获，转录本不会在转移过程中"糊"开。
2×2 µm 连续阵列 + CytAssist 探针捕获，限制转录本扩散
优势 2
多组织兼容性
适用于人或小鼠新鲜冷冻、固定冷冻和 FFPE 样品，包括新鲜切片、存档样本（室温 / 4 ℃ 保存 6 个月）及封片样本。支持 H&E 染色和免疫荧光染色，同一组织切片的高分辨率空间转录组学技术可以增强 H&E 染色和免疫荧光成像的效果。
FF / FxF / FFPE 三类样本兼容，存档样本同样可做
优势 3
全转录组覆盖
使用基于探针的检测方法（RNA-templated ligation，RTL），覆盖人类约 18,000 个基因、小鼠约 19,000 个基因，每个基因设计 3 组探针以提高检测灵敏度。探针法对 FFPE 里已部分降解的 RNA 比常规 poly(A) 捕获更耐受。
RTL 探针法：人 ~18,000 / 小鼠 ~19,000 基因，每基因 3 组探针
03
技术原理
Visium HD 玻片有两个捕获区域，每个区域为 6.5×6.5 mm，捕获区域周围有基准框架用于图像对准。捕获区域排列着连续的寡核苷酸阵列，由约 1100 万个 2×2 µm 的条形码方阵组成，这些方阵连续排列且无间隙，实现全组织覆盖和单细胞级分辨率。
每条寡核苷酸上带四段信息，各管一件事：
① 30 nt 的 poly(dT)
通过碱基互补配对，捕获带有 poly(A) 尾的探针连接产物。它负责"把东西接住"。
② 唯一分子标识符（UMI）
用于识别文库制备和测序过程中产生的重复分子——同一个原始分子的多次扩增只算一次，避免把 PCR 重复当成表达量。
③ 空间条形码（Spatial Barcode）
每个 2×2 µm 的条形码方阵具有唯一的空间条形码，用于标记转录本的空间位置信息。这是整张图的坐标来源。
④ Illumina TruSeq Read 1 测序引物
用于文库构建和双端测序，让捕获产物能直接上 Illumina 平台。
Visium HD 玻片：2 个 6.5×6.5 mm 捕获区域 + 基准框架 + 2×2 µm 连续条形码方阵
04
实验流程
组织切片的制备过程包括组织切片、脱蜡（适用于 FFPE 组织）、染色和在载玻片上成像。然后将两张组织切片和一张包含两个捕获区域的 Visium HD 切片放入 CytAssist 仪器中，使组织切片与两个 Visium 捕获区域对齐。仪器内部会捕获明场图像，以便为数据分析提供空间定位，随后对组织进行透化处理，并将转录组探针转移到 Visium HD 切片上。探针延伸后，将样品洗脱并转移到新的试管中，构建基因表达文库。最终的基因表达文库将进行测序。
1切片与染色
组织切片；FFPE 组织需脱蜡；随后染色并在载玻片上成像
2CytAssist 上机
两张组织切片与一张 Visium HD 玻片放入仪器，切片与两个捕获区域对齐
3明场成像与透化
仪器内部捕获明场图像用于空间定位，随后对组织进行透化
4探针转移与延伸
转录组探针转移到 Visium HD 切片上，探针延伸
5洗脱与建库
样品洗脱并转移到新试管中，构建基因表达文库
6测序
基因表达文库上机测序，满捕获区域建议 ≥2.75 亿 read pairs
Visium HD 全流程：切片制备 → CytAssist 对齐 → 透化捕获 → 探针转移延伸 → 洗脱建库 → 测序
05
实测数据
实测 1 · FFPE 乳腺癌导管原位癌全转录组图谱
Visium HD 对该 FFPE 导管原位癌人类乳腺癌样本进行分析，构建了无偏倚的全转录组图谱，并识别了肿瘤微环境中的主要细胞类型和状态。
FFPE 人乳腺癌 DCIS：无偏倚全转录组图谱与微环境细胞状态
实测 2 · 同一组织切片的组织学与空间分析
同一组织切片的组织学和空间分析。A、B 分别显示同一人类结肠癌切片的 H&E 染色 (A) 和基于图形的聚类 (B)。C、D 分别显示同一小鼠小肠切片的 alpha-SMA（红色）、WGA（绿色）和 DAPI（蓝色）的免疫染色 (C) 以及基于图形的聚类 (D)。黑色箭头表示在连续切片 1 (E、F) 中存在单个浆细胞，JCHAIN 表达；在连续切片 2 (G、H) 中不存在浆细胞，JCHAIN 表达也未表达。
组织学与空间聚类一一对齐：人结肠癌 H&E / 小鼠小肠免疫染色
实测 3 · 高质量且可重复的数据
使用 Visium HD 获得高质量且可重复的数据。A–C 分别显示人类结肠癌的 H&E 染色 (A) 及其 UMI 图 (B) 和 UMI 分布图 (C)。D、E 分别显示健康人类胰腺 2 个重复样本的 UMI 图 (D) 以及重复样本之间 UMI 分布的高度相关性 (E)。
重复样本 UMI 分布高度相关，数据可重复
实测 4 · 转录本精确定位（约 95% 落在预期区域）
使用 CytAssist 探针捕获技术实现转录本的精确定位。H&E 染色与标记基因表达的叠加显示转录本在预期位置的准确定位 (A)。基于图的小鼠小肠聚类 (B)。E 图中黑框内的区域被放大以显示 H&E 染色 (C)，其中红色区域表示预期包含表达 Lyz1 和 Defa21 转录本的潘氏细胞的隐窝区域，黄色区域表示不表达潘氏细胞标记物的相邻肌肉层。H&E 与潘氏细胞标记基因的叠加 (D)。值得注意的是，约 95% 的 Lyz1 和 Defa21 转录本正确定位在包含潘氏细胞的隐窝区域中。
约 95% 的 Lyz1 / Defa21 转录本定位在预期的隐窝区域
以上实测图与说明引自 10x Genomics Visium HD 公开数据（人 FFPE 乳腺癌、人结肠癌、小鼠小肠、健康人胰腺）。
06
样本要求
| 项目 | 要求 | 说明 |
|---|
| 兼容样本类型核心 | 人或小鼠的 FFPE、新鲜冰冻（FF）、固定冰冻（FxF） 组织切片 | 含 mRNA 的组织切片即可；已制好的玻片切片、存档 FFPE 蜡块均可上机 |
| 切片厚度 | 支持 3–10 µm；常规 5 µm（FFPE）、10 µm（FF / FxF） | 10x 在 3–10 µm 范围内做过验证，内部常规用 5 µm；特殊组织可提前沟通优化 |
| 组织尺寸 | 目标区域需落在 6.5 × 6.5 mm 捕获区域内，每张玻片 2 个捕获区域 | 组织大于捕获区域时，需在取材或切片阶段圈定感兴趣区域 |
| RNA 质量（FFPE） | 建议 DV200 > 30% | 低于 30% 的样本在既往版本中也出过可用数据，但建议先做质检评估再决定是否上机 |
| 存档样本 | FFPE 蜡块：10x 已测试至 5 年；玻片上已切组织：室温 / 4 ℃ 保存 6 个月 | 更久的样本建议先评估 DV200，再决定是否投入正式实验 |
| 染色方式 | H&E（形态学）与 免疫荧光 IF（蛋白共检）均兼容 | 同一张切片共检，形态与分子信息严格配准；蛋白共检需提前确认抗体 |
| 测序深度 | 组织铺满整个捕获区域时，建议 ≥2.75 亿 read pairs | RNA 丰度高的组织可继续加大测序量以提升灵敏度；具体按课题问题与组织类型确定 |
| 样本形态与运输 | 蜡块 / 玻片切片 / OCT 包埋块三种形态均可，寄送条件不同 | 寄样前请与技术顾问确认样本形态、固定方式与运输条件后再发货 |
关于立项前确认：Visium HD 对组织形态与 RNA 完整度比较敏感，尤其是存档 FFPE 样本。建议在项目启动前先做 DV200 评估；样本寄送前请与技术顾问确认形态（蜡块 / 玻片切片 / OCT 包埋块）、固定方式与运输条件，避免到场后发现不符合上机要求。
07
分析内容
标准分析 STANDARD
数据质控与图像配准Space Ranger 解条形码、序列比对、组织区域识别、H&E 图像配准
多尺度 bin 定量2 µm 原始数据输出；提供多种 bin 尺寸，8×8 µm 为推荐起点
降维聚类与注释PCA / UMAP 聚类，Marker 基因与区域类型注释
空间差异表达区域间 / 分组间差异基因与空间表达模式
功能富集GO / KEGG / GSEA，通路层面解释空间分区
高级分析 ADVANCED
自定义 bin 与细胞核分割Space Ranger 支持 10–100 µm 整数 bin；基于 H&E 的核分割获取类单细胞信号
细胞类型去卷积联合 scRNA-seq 参考图谱，估计每个 bin 的细胞组成
空间邻域与细胞通讯邻域富集分析、配体–受体互作推断
H&E 多模态联合病理形态注释与分子分区叠加，IF 蛋白共检数据联合
连续切片整合与 3D 重构多切片拼接对齐，三维表达图谱
8×8 µm bin 之所以作为推荐起点：哺乳动物多数细胞直径在 8–100 µm，8×8 µm 的 bin 每个格子里能装下更多转录本，聚类和差异表达的统计功效更稳，同时仍保持单细胞尺度。
08
应用案例
案例一
鼻息肉
CRSwNP · GZMK⁺ CD8⁺ T 细胞与成纤维细胞互作
Granzyme K⁺ CD8⁺ T cells interact with fibroblasts to promote neutrophilic inflammation in nasal polyps
颗粒酶 K 阳性 CD8 阳性 T 细胞与成纤维细胞相互作用促进鼻息肉中的中性粒细胞炎症
期刊：Nature Communications（IF 15.7） · 发表时间：2024 年 11 月
阅读原文：doi.org/10.1038/s41467-024-54685-1
研究目的：常规 Visium 平台无法达到单细胞分辨率（55 µm 的检测点包含 1–10 个细胞），难以精准解析细胞间的相互作用，而 Visium HD 平台能提供单细胞尺度的空间分辨率（2×2 µm 的条形码方块且无间隙）。因此作者使用该平台对更多样本进行分析，以更精确地观察免疫细胞和结构细胞在鼻组织中的空间分布情况，进而揭示细胞间的相互作用，尤其是 GZMK⁺ CD8⁺ T 细胞与成纤维细胞之间的关系，为深入理解 CRSwNP 的发病机制提供更有力的证据。
Visium HD 下鼻息肉组织的免疫细胞空间分布与细胞互作
细胞分布与组成
对 4 例对照样本和 6 例鼻息肉（NP）样本进行分析后发现，在 NP 组织的固有层中鉴定并可视化了 CD8T_GZMK 和 CD8T_GZMB 细胞。NP 组出现大量免疫细胞浸润，其中巨噬细胞、浆细胞、B 细胞和 CD4⁺ T 细胞的数量比 CD8T_GZMK 更多。与对照下鼻甲（CIT）组相比，NP 组中 CD8T_GZMK、B 细胞和 CD4⁺ T 细胞的比例增加，而平滑肌细胞的比例显著下降，不过成纤维细胞或上皮细胞的比例未发生明显变化。
细胞间相互作用
通过 Squidpy 进行邻域富集分析，发现 CD8T_GZMK 与成纤维细胞之间存在正向邻域富集关系，即这两种细胞在空间上距离更近，且这种关系具有特异性，其他免疫细胞与成纤维细胞之间并未展现出更强的邻域富集关系。此外，基于 Visium HD 数据的配体–受体分析表明，GZMK⁺ CD8⁺ T 细胞与成纤维细胞之间通过 CXCR4–CXCL12 轴进行细胞通讯，进一步证实了两者之间的密切联系。
09
常见问题
Visium HD 玻片的捕获区域架构是什么？
Visium HD 空间基因表达玻片包含两个 6.5 × 6.5 mm 的捕获区域，其中一片连续的寡核苷酸排列成数百万个 2 × 2 µm 条形码方块，无间隙，可实现单细胞尺度的空间分辨率。
哪些样品与 Visium HD 兼容？
Visium HD 与含有 mRNA 的人和小鼠新鲜冷冻、固定冷冻和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片兼容。这包括存档的 FFPE 块和载玻片上的预切片组织。
哪些组织染色剂与 Visium HD 兼容？
Visium HD 空间基因表达与苏木精和伊红（H&E）染色兼容，用于形态学信息；与免疫荧光（IF）染色兼容，用于蛋白质共检测。
组织切片要多厚？
官方支持范围为 3–10 µm，内部常规使用 5 µm。实际操作中 FFPE 常用 5 µm、新鲜冰冻与固定冰冻常用 10 µm；不同组织的透化行为有差异，遇到特殊组织建议先做小范围条件确认。
拿到的是 2 µm 数据还是 8 µm 数据？
两个都有。原始数据集以 2 µm 输出；同时提供若干种 bin 尺寸，其中 8 × 8 µm 是推荐的可视化与分析起点。原因是 8×8 µm 的 bin 每个格子里转录本更多，聚类和差异表达的统计功效更好，而哺乳动物多数细胞直径在 8–100 µm，这个粒度仍然算单细胞尺度。Space Ranger 也支持在 10–100 µm 之间按 2 µm 整数自定义 bin。
测序要测多深？
组织铺满整个捕获区域时，官方建议最低 2.75 亿 read pairs。实际还要看课题需要多少测序饱和度；RNA 丰度高的组织想再多挖一些低表达基因，可以在这个基础上继续加量。
FFPE 蜡块放了很久还能做吗？
先看 DV200。官方建议 > 30%，低于 30% 的样本在既往版本中也出过可用数据，但不建议直接押上去。10x 已测试过最长 5 年的 FFPE 蜡块；玻片上已切组织的保存建议是室温或 4 ℃、6 个月内。老样本建议先做质检评估，再决定是否投入正式实验。
项目周期一般多长？
样本与 RNA 质检合格后，切片、CytAssist 上机、建库测序约 4-5 周，标准分析约 2 周；细胞核分割、自定义 bin、连续切片 3D 重构等高级分析按需求另行约定。
