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蛋白组 · 标记定量

iTRAQ / TMT 标记定量蛋白质组

样本多、又必须横向比的时候，标记定量是最稳的选择：把每个样本用不同同位素标签标上，等量混成一管再上机。混合之后，样本之间的差异就只体现在报告离子的强度上，前处理和后期的仪器波动对每个样本的影响基本一致——这也是它几乎没有定量缺失值的原因。

  • 8/10/11 标
  • 一次多样本
  • 无定量缺失值
  • 重复性好
  • 适配复杂样本
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11个样本 / 次TMT 最多可同时标记 11 组
0定量缺失值混样上机，各通道同一肽段必然共检出
≥50µg 蛋白起送组织 ≥50 mg / 细胞 ≥1×10⁶
4-6周常规项目周期
01

技术简介

iTRAQ 和 TMT 分别是美国 AB Sciex 公司和 Thermo 公司研发的多肽体外标记定量技术。原理是利用 8 种或 10 种同位素标签标记不同样品中的肽段，等量混合后质谱检测；通过特异性标记多肽的氨基酸基团，一次上机可实现 8 种或 10 种不同样本中蛋白质及肽段的相对定量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。TMT 目前最多可做到 11 标。

典型适用于刺激前后细胞、病理与健康组织、癌症与癌旁组织的全蛋白质组定量分析。

它和非标定量（LFQ）的根本区别在“比较发生在哪一步”：LFQ 是每个样本单独上机、事后比信号强度；标记定量是在样本混合那一刻就把比较关系固定下来。所以只要同一组标签内，样本间的相对关系非常稳；代价是通道数有上限，超过 11 个样本就得分批，而不同批次之间不能直接比——这一点在设计分组时就要想清楚。

TMT 技术路线：10 个样本分别处理与酶解，用 TMT 126–131 十种同位素标签标记，混合后分级净化，经 LC-MS/MS 分析并用 Proteome Discoverer 定量
TMT 技术路线：多样本分别酶解 → 同位素标记 → 混合 → 一次 LC-MS/MS
02

技术优势

准确性高

同一管混合上机，各通道经历完全相同的色谱与离子化过程，样本间的系统误差被大幅抵消。

无定量缺失值，重复性好

混样之后同一肽段在所有通道同时被检测，不存在“这个样本有、那个样本没有”的缺失值问题，做统计时不用填补。

通量高

一次上机最多 11 个样本（TMT），对照组与多个处理组可以放在同一批里比较，省时间也省成本。

适用复杂样品蛋白定量

组织、细胞这类复杂样本同样适用。相比非标定量，标记法对样本前处理的微小差异更宽容。

一次最多可实现 11 个样品定量

TMT 11 标可覆盖 10 个实验组 + 1 个参照，做剂量梯度或时间序列时特别顺。

适合做筛选

在机制研究的早期阶段快速锁定差异蛋白，再用 PRM 或 WB 验证关键分子，是标准的“先筛后验”路径。

03

技术流程

1

样本处理与蛋白提取

各组样本分别裂解、提取蛋白、BCA 定量并检查降解

2

还原烷基化与酶解

打开并封闭二硫键，胰酶酶解为肽段，各组分别除盐

3

同位素标记

各组肽段用不同通道的 iTRAQ / TMT 试剂标记

4

等量混合

按总肽量等量混合成一组，多组则分批标记

5

分级与 LC-MS/MS

混合肽段做高 pH 反相分级，降低复杂度后上机检测

6

定量与差异分析

按报告离子强度计算各通道比值，筛选差异蛋白并做功能富集

iTRAQ 试剂工作流程：8 个样本平行变性酶解、分别用 113–121 八种试剂标记、混合后 MS 检测，同一肽段母离子相同（1197.61 m/z），由报告离子实现定量、由二级谱实现鉴定
iTRAQ 试剂工作流程：母离子相同，靠报告离子区分样本

设计分组时最容易出错的地方：不同标记批次之间的数据不能直接比较。如果一个课题有 20 个样本，就会被拆成两批，每批都要带一个共同的参照通道（bridge sample）才能把两批数据连起来。样本分组请提前和技术顾问一起排，不要等上机前才发现排不下。

04

样本要求

标记定量要求各组样本的起始量尽量一致——量差太大，标记效率就会有差异，最后会变成假阳性。

样本类型常规送样量最低送样量说明
蛋白溶液 / 蛋白量≥50 µg≥30 µg（仅做蛋白鉴定 ≥10 µg）浓度不低于 0.1 µg/µL；澄清、无色、不粘稠；−20 ℃ 保存，冰袋送样
组织≥50 mg5–10 mg液氮速冻后 −80 ℃ 保存，干冰寄送；脂肪、骨、皮肤等特殊组织加量
细胞≥1×10⁶≥1×10⁵细胞沉淀干体积 ≥20 µL；PBS 洗两遍后离心去上清，液氮速冻
血浆 / 血清≥100 µL≥50 µL避免溶血；采血后尽快分离，最晚 48 h 内完成，防止蛋白降解
外泌体≥2×10⁹ 颗粒（NTA）≥1×10⁹ 颗粒相当于 BCA 蛋白总量 40 µg / 20 µg；分离后加 100 µL PBS 保存，不超过 200 µL
FFPE 切片10 片以上—每片厚 10 µm、组织面积 1 cm²（约 10 µg/片）
IP Beads正常 IP 后的干 Beads—PBS 洗三遍后去掉上清保留干 Beads，取 3/4 送样，−20 ℃ 冰袋寄送
三个容易踩的点：① 各组蛋白量务必对齐——先分别定量，再按相同总量取用；某组偏少时宁可整批降到最低量，也不要让某一组“凑数”；② 避免含干扰物的缓冲液——高浓度尿素、SDS、Triton 和盐会严重影响标记效率，送样前请说明裂解液成分；③ 组织要取性质一致的区域——同一器官的不同部位蛋白构成差异很大，癌与癌旁尤其要请病理确认取材位置。
05

应用案例

案例一
IF 9.6 Cell Death & Disease · 肿瘤机制

PSMA1 mediates tumor progression and poor prognosis of gastric carcinoma by deubiquitinating and stabilizing TAZ

PSMA1 通过去泛素化并稳定 TAZ 介导胃癌的肿瘤进展和不良预后

期刊：Cell Death & Disease（IF 9.6，2024 JCR）　·　发表时间：2022 年 11 月（13 卷）　·　阅读原文：doi.org/10.1038/s41419-022-05417-0

研究设计：为了找出 PSMA1 可能作用的特异性底物蛋白，作者做了 TMT 标记定量蛋白质组：以 PSMA1 敲低（siRNA）的胃癌 BGC-823 细胞与对照组做全蛋白组比较，看敲低之后哪些蛋白的表达水平发生了变化，再顺着候选蛋白往下做机制验证。

核心结果：蛋白组结果显示 PSMA1 敲低后 YAP 和 TAZ 的蛋白水平显著下降；后续实验证明 PSMA1 通过去泛素化作用稳定 TAZ，进而促进胃癌的进展并与不良预后相关。差异蛋白的火山图与 GO 富集分析构成了这条线索的起点——先看到“敲掉 PSMA1 之后 TAZ 掉了”，才去追“为什么会掉”。

为什么这类课题适合用标记定量：敲低组与对照组就两个样本、要的是全蛋白组的横向比较，TMT/iTRAQ 的双通道或少数通道设计正好——混样上机，两组在同一条件下直接比，不用考虑批次效应。这类“一个干预、一个对照，先看全蛋白组变化”的设计，是标记定量最典型的用法。

PSMA1 敲低 BGC-823 细胞的 TMT 蛋白组结果：实验流程与热图、差异蛋白数量统计、火山图、差异基因热图，以及 YAP/TAZ/PSMA1 的 Western Blot 验证
从 TMT 蛋白组到 YAP/TAZ 的验证链（A–F）
06

应用案例二

案例二
2024 J Proteome Res · 临床组织 / 标志物

Identification of FGG as a Biomarker in Early Gastric Cancer via Tissue Proteomics and Clinical Verification

通过组织蛋白质组学与临床验证鉴定 FGG 作为早期胃癌生物标志物

期刊：Journal of Proteome Research　·　发表时间：2024 年（23 卷 11 期，5122–5130）　·　阅读原文：doi.org/10.1021/acs.jproteome.4c00624

研究设计：用 TMT 标记定量蛋白质组比较早期胃癌组织与对照胃黏膜组织的蛋白表达谱，筛出差异蛋白，再通过临床样本（组织与血清）做验证，最终锁定 FGG（纤维蛋白原 γ 链）作为早期胃癌的候选生物标志物，并评估其诊断价值。

核心结果：研究发现 FGG 在早期胃癌组织中表达显著改变，并在独立临床样本中得到验证，提示其作为早期胃癌检测标志物的潜力。

这条路径可以直接复制：标记定量筛差异 → 锁定单一候选 → 临床样本验证。临床组织样本做 TMT 的关键在取材：肿瘤区域要请病理确认细胞纯度，对照要取无肿瘤浸润的黏膜，否则差异里混的全是组织构成差别。

07

常见问题

iTRAQ 和 TMT 现在选哪个？
实际项目里 TMT 更常用：通道数更多（最多 11 标）、试剂批次稳定、配套分析软件成熟。iTRAQ 主要优势是成本略低，8 标也够用。如果是新课题，建议直接用 TMT；要和老数据衔接再考虑 iTRAQ。
为什么说标记定量“没有缺失值”？
因为各样本在标记后混成一管、一起上机，同一个肽段在所有通道里同时被采集，不存在某个样本里“没测到”的情况。这对统计很友好——非标定量常常要面对大量缺失值，处理方式不同结论就会变。
样本超过 11 个怎么办？
分批标记，每批都带一个共同的参照样本（bridge），后续用参照通道把不同批次的数据连起来。这会增加一个样本的成本，但比“硬凑成一批”可靠得多。分组方案请在送样前一起排。
标记定量和 LFQ 怎么选？
样本数少（≤11 组）、组间必须严格横向比、样本前处理条件略有差异的，选标记定量；样本数多（几十上百例）、想做大队列趋势分析的，选 LFQ 或 DIA。
差异蛋白筛出来之后怎么验证？
挑变化倍数大、文献支持多的 3–5 个，用 WB 做蛋白水平验证；需要跨样本定量比较或没有好抗体的，用 PRM。案例一就是典型路径：TMT 筛出 YAP/TAZ 变化，再用 WB 确认。
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