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三代测序 · 长读长宏基因组

全长宏基因组测序

二代宏基因组能告诉你"有哪些基因"，但组装结果高度碎片化——重复序列把组装图切断了。长读长直接跨过这些区域，让完整环化的宏基因组组装基因组（cMAG）、完整的 rRNA 操纵子、完整的次级代谢产物合成基因簇从"偶然得到"变成"可以稳定拿到"。耐药基因和转座酶是否在同一条序列上，这个差别决定了你能否讨论耐药性的可移动性。

  • 完整环化 cMAG
  • 完整 BGC 基因簇
  • 耐药基因可移动性
  • 菌株相位
  • antiSMASH · GTDB-Tk
  • Oxford Nanopore
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cMAG完整环化基因组
206个单份土壤环化组装
94.9Gb土壤样本实测中位深度
0gap染色体 · 质粒 · 前噬菌体
01

技术简介

宏基因组测序的对象没变：提取样本的总 DNA，随机测序，不做靶向扩增。变的是读长。短读长（100–300 bp）在宏基因组里的根本瓶颈不在"测不到"，而在装不起来——微生物基因组里的重复序列会把组装图切断，结果的连续性上不去。

典型的重复 / 复杂区域短读长下的后果长读长如何处理
rRNA 操纵子常 5–7 个拷贝且高度保守，组装时塌缩成一条，MAG 里经常拿不到完整 16S单条 read 即可跨越整个操纵子
插入序列 IS、转座酶多个拷贝互相混淆，contig 在此断裂跨过重复单元，保留两侧独特序列
整合性接合元件 ICE、噬菌体整合位点移动元件与宿主染色体边界无法确定完整保留整合上下文
NRPS / PKS 基因簇大模块、高度重复，几乎无法完整组装整簇落在同一条 contig 上
近缘菌株的微多样性de Bruijn 图上形成"气泡"，图塌缩或错连可分辨并支持菌株相位（phasing）
02

技术优势

1

能拿到完整环化的基因组，而不只是碎片

Burian 等发表于 Nature Biotechnology 的工作，用 ONT 长读长从单份森林土样本中直接组装出 206 个环化基因组，其中 163 个满足 CheckM 完整度 >90%、污染 <5% 的近完整标准；合并线性组装后共 563 个完整或近完整的单 contig 组装。这是"从环境样本里直接拿到完整细菌基因组"最直观的一条实证。

2

耐药基因的可移动性可以讨论了

完整的 cMAG 能把抗性基因（ARG）、转座酶、整合酶、前噬菌体、插入序列放在同一条 contig 上。短读长下这些信息被切成碎片，"这个耐药基因能不能水平转移"这个问题根本没法回答。

3

完整 rRNA 操纵子，打通基因组与 16S 数据

长读长组装能恢复数千个完整 rRNA 操纵子，让 MAG 直接对接 16S 数据库。Sereika 等 2025 年 Nature Microbiology 的工作显示，把这些 MAG 用于短读长数据分类，种级分类率中位数从 17.3% 提升到 36.8%。

4

完整的次级代谢产物合成基因簇

NRPS／PKS 这类大模块基因簇在短读长下几乎无法完整组装。长读长目录中多数 BGC 与 CRISPR-Cas 防御岛可被判定为完整。Bağcı 等 2025 年 GigaScience 以 148 Gb 的 ONT PromethION 数据（辅以短读长抛光）从单份森林土鉴定出超过 11,000 个 BGC，其中 >99% 在现有数据库中无匹配。

5

菌株相位与泛基因组分析

长读长能跨越数百 kb 的片段，把相邻变异连在同一条 read 上，因此可以做相位（phasing）——判断两个变异是否来自同一个菌株。近缘菌株共存时的微多样性，短读长基本无解；有了相位信息就能进入泛基因组与微生物 GWAS 层面。配合 nanoMDBG、myloasm 这类新一代长读长组装器，ONT 数据回收的近完整 MAG 数量已可比肩更高准确率的平台。

6

可以免组装，直接在读段层面分类

长读长信息密度高，单条 read 常已足够判读物种，可以在读段层面直接做种／株级分类。适合大规模筛查或样本量很大的队列，省去组装环节的算力与时间。

03

技术流程

1

采样与保存

液氮或 −80 ℃ 速冻，减少冻融；低生物量样本同步设空白对照。

2

HMW DNA 提取

温和裂解避免机械剪切，优先保留 >20 kb 片段。

3

去除抑制剂

土壤／沉积物的腐殖酸与多糖是读长的头号杀手。

4

片段质检

脉冲场或片段分析仪确认主带长度，不达标不进建库。

5

建库

ONT 连接法（LSK114）或条码试剂盒建库，优先保留超长片段。

6

上机测序

PromethION（P24／P2）产出长读长，实时监控产量与读长分布。

7

碱基识别

Dorado 高精度或超高精度模式解码；需要时启用 Duplex 模式提升单条准确率。

8

质控交付

读长分布、Q 值、产量三项确认后进入生信流程。

04

送样要求

高分子量 DNA 是硬门槛。短读长对 DNA 片段化几乎不敏感，长读长完全相反——读长上限由你送来的 DNA 长度决定，测序本身无法补救。土壤、沉积物、粪便中的腐殖酸、多糖与核酸酶都会显著压低读长。

样本类型送样量建议处理与保存提示
粪便 / 肠道内容物≥500 mg无菌管，液氮速冻后 −80 ℃；干冰运输宿主占比低，是最容易达标的类型
土壤 / 沉积物≥10 g过筛去根系石块，−80 ℃ 或干冰抑制剂最重、多样性最高，需专门优化提取
水体滤膜 3–5 张0.22 µm 或分级滤膜，记录滤水量；−80 ℃生物量低，务必同步送现场空白
组织 / 拭子 / 体液个案评估−80 ℃／干冰宿主 DNA 占比可能极高，先评估去宿主方案
已提取 DNA总量 ≥3 µg，浓度 ≥30 ng/µL−80 ℃，干冰运输，严禁反复冻融与剧烈吹打主带需 >20 kb；OD260/280 在 1.8–2.0，无色无沉淀
05

文献案例

一篇把长读长推到陆地生态系统的规模，一篇展示了"从序列直接到活性分子"的完整链条，一篇用迄今最深的单样本数据给出了多样性的现实上限。三篇均由 Oxford Nanopore 平台完成。

期刊 / 年份研究与长读长宏基因组相关的要点DOI
GigaScience
2025;14:giaf135		 超深度长读长宏基因组捕获土壤微生物的分类与合成潜力
Bağcı C, et al.		 对单份德国森林土样本做了迄今最深的测序之一：148 Gb 的 ONT PromethION 长读长（read N50 12.2 kb）+ 122 Gb 短读长，合计 270 Gb。混合组装得到 10.5 Gb 的组装结果（contig N50 77.8 kb），分箱与精修后获得 837 个 MAG，其中 466 个达到高／中质量标准，且几乎没有近缘的可培养代表。注释出 超过 11,000 个生物合成基因簇，其中 >99% 在现有数据库中找不到匹配。最有价值的是它对边界的量化：稀疏曲线与 k-mer 模型显示，即便到这个深度也只覆盖了现存多样性的一小部分，要接近饱和需要 10 Tbp 以上——这条结论是所有土壤宏基因组项目规划深度时的现实参照。 10.1093/gigascience/giaf135
Nature Microbiology
2025;10(8):2018-2030		 基因组分辨的长读长测序扩展陆地生境的已知微生物多样性
Sereika M, et al.		 用 ONT PromethION（P2／P24，SQK-LSK114 化学）对 15 类陆地生境的 154 份土壤与沉积物样本做深度长读长测序，累计 14.4 Tbp，每样本中位 94.9 Gb（IQR 56.3–133.1），read N50 中位 6.1 kb；配合自研的 mmlong2 流程（纯长读长，不做短读长抛光），每样本中位回收 154 个高／中质量 MAG，合计 23,843 个，去冗余后为 15,640 个种级 MAG，其中 15,314 个为此前未被描述的物种，覆盖 1,086 个未表征属，把原核生物系统发育多样性扩展了约 8%。研究明确建议每样本至少测 60 Gb（实测至 100 Gb 仍未见饱和），并发现农业土壤的 MAG 回收率系统性偏低。多数 MAG 携带完整 16S rRNA 基因，将其用于短读长数据分类使种级分类率中位数从 17.3% 升至 36.8%；所得 BGC 与 CRISPR-Cas 防御岛多数判定为完整。 10.1038/s41564-025-02062-z
Nature Biotechnology
2026;44:1353-1360		 Tbp 级土壤宏基因组长读长测序挖出活性分子
Burian J, et al.		 针对土壤这个最难提取的类型，先开发了一套释放大片段、高质量宏基因组 DNA 的方法，把 read N50 做到 32.8 kb（约为常规方法的 200 倍），再配合优化的 ONT 纳米孔测序与 Dorado duplex 碱基识别，无需短读长抛光即可完成组装。从单份森林土的 2.5 Tbp 数据中组装出 206 个环化基因组（其中 163 个满足 CheckM >90% 完整、<5% 污染），加上线性组装共 563 个完整或近完整单 contig 组装。随后用 HMM 分区组装钓取含腺苷化结构域的 NRPS 基因簇，得到 118,000 条 contig（N50 约 111 kb）；聚焦含 ≥4 个 A 结构域的 338 条，BiG-SCAPE 解析出 366 个基因簇，仅 6 个能在已表征数据库 MiBig 中找到对应物，且仅 20.5% 能回贴到全库组装——说明分区组装确实进入了稀有微生物组。研究随后走"预测化学结构 → 全合成（synBNP）"路线，把 NRPS 簇直接转化为活性分子，发现了多重耐药病原体有效、作用机制罕见的新抗生素。 10.1038/s41587-025-02810-w
06

常见问题

什么时候必须上长读长，二代宏基因组不够吗？
取决于你要的产出。只要物种组成与功能通路的相对丰度，二代够用且便宜，流程成熟、可比性好。要下面这些，就必须长读长：完整环化的基因组（cMAG）、耐药基因与移动元件的共定位、完整的次级代谢产物合成基因簇、完整 rRNA 操纵子、菌株层面的相位与泛基因组分析。判断标准很直接——你的结论是否依赖"这两段序列是否在同一条 DNA 上"。如果是，短读长回答不了。
DNA 提不出高分子量怎么办？
这是长读长项目最主要的失败原因，而且测序阶段无法补救。土壤、沉积物、粪便中的腐殖酸、多糖和核酸酶会严重压低读长。可选做法包括改用温和裂解方案、专门的 HMW 提取试剂盒、增加清洗步骤去除抑制剂、减少冻融与机械剪切。建议先送一到两份样本做提取测试，确认主带是否 >20 kb 再决定整批上量——这一步的成本远低于测完发现读长不行。
MAG 的质量怎么判断？可以用来下菌株级结论吗？
按 MIMAG 标准：高质量（HQ）要求完整度 ≥90%、污染度 ≤5%，并含完整 rRNA 操纵子与 tRNA 基因；中等质量（MQ）为完整度 ≥50%、污染度 <10%。流程上用 CheckM2 评估完整性与污染，但必须加跑 GUNC 检测嵌合——CheckM2 判出的"高完整性"有可能来自跨属嵌合，这是长读长 MAG 分析里最容易踩的坑。至于菌株级结论：MAG 本质是群体共识序列，共存的近缘菌株会被折叠，菌株级结论建议用专门的多态性或相位分析方法交叉验证。
ONT 的准确率会不会拖累 MAG 质量？要不要做长短读长混合（hybrid）？
单条 read 的准确率确实低于短读长，但组装是群体共识，深度会把它抹平——纯 ONT 长读长流程产出近完整 MAG 已有大量公开实证，上面那篇 Nature Microbiology 的 15,640 个种级 MAG 就是在不做短读长抛光的前提下得到的。残余风险集中在均聚物与低复杂度区，会造成蛋白编码区移码，所以常规做法是用 medaka 或 Dorado Polish 抛光一遍；要更高单条准确率再上 Duplex 模式。至于混合策略：预算有限又想兼顾准确率与连续性时，"用短读长覆盖全部样本、挑选子集做长读长深测"的分层设计往往最划算；反过来，如果你的目标就是完整环化的基因组，纯长读长足够，加短读长的边际收益有限。
数据量不够会怎样？中途能加测吗？
数据量不足直接表现为 MAG 数量少、完整度低、稀有类群检不出，而且很难补救——后期补测的样本会引入批次效应，组装与分箱的结果不再可比。所以深度必须在方案阶段定好，参考上文那张表按分析目标和群落复杂度估算。土壤、沉积物这类高多样性环境建议 ≥60 Gb/样本；如果目标是稀有类群的 BGC 挖掘，还要往 150 Gb 以上甚至 Tbp 级规划。
低丰度物种能测到吗？
这是当前的技术边界，不要抱过高预期。cMAG 的回收率高度依赖群落均匀度、丰富度和目标类群的相对丰度；极低丰度（<0.1%）的类群即使在 100–250 Gb 深度下也难以闭环。如果目标就是稀有类群，有两种思路：一是大幅加深度（Tbp 级），二是用分区组装——先用 HMM 在 reads 里钓出含目标结构域的读段单独组装，上面那篇 Nature Biotechnology 的工作就是用这个方法进入了常规组装覆盖不到的稀有微生物组。
算力和分析周期会不会很高？
会，这是需要提前规划的部分。几十个样本做到组装与分箱，算力需求远超普通工作站，通常要在高性能集群或云上跑。深度学习分箱工具（如 COMEBin、SemiBin2）精度最高，但内存与时间代价明显。做法上建议用 Nextflow 或 Snakemake 把流程固化，保证可复现；我们交付时会一并给出工具版本与参数。
样本需要多少重复？
生物学重复建议每组 ≥6 个，条件允许做到 10 个更稳。另外分箱本身受益于样本数量——多样本共变信息能提升分箱质量，有研究显示超过 10 个样本后收益明显，约 20 个样本后趋于平台。所以做 MAG 项目时，样本数不只是统计需求，也直接影响组装质量。
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