RNA 结合蛋白（RBP）结合在 RNA 的哪个碱基上，决定了这个蛋白是调控剪接、稳定性还是翻译。传统 CLIP 里，逆转录一走到交联位点就停下来，这些"断在半路上"的 cDNA 反而被当作废片段丢掉。eCLIP 把它们接上接头、建成文库，于是交联位点本身变成了可读的信号——RBP 的结合位置精确到单个碱基。
RNA 结合蛋白（RBP）在 RNA 生命周期的每一步都在场：剪接、切割、加尾、稳定、定位、编辑、翻译。RBP 与 RNA 的结合是转录组和蛋白质组调控的关键节点，功能一旦缺失就会引发多种疾病。要研究 RBP，首先得知道它在细胞里到底结合在哪些 RNA 的哪些位置上。
2009 年，加州大学圣地亚哥分校 Gene W. Yeo 团队发表 CLIP-seq，在人胚胎干细胞中画出剪接调控因子 FOX2 的 RNA 图谱，奠定了这一类方法的基础。CLIP 的思路是用紫外交联把 RBP-RNA 瞬间"钉"在一起，再用抗体把蛋白拉下来，顺带把它结合的 RNA 一起带出来测序。
2016 年，Nature Methods 报道了 eCLIP（enhanced CLIP）的改进：逆转录酶通常在 RNA-RBP 交联位点终止，eCLIP 在逆转录之后把单链 DNA adapter 连到 cDNA 片段的 3′ 端，用逆转录引物和 adapter 引物做 PCR——那些在交联位点中断的 RNA 分子由此完整保留下来，交联位点直接转化为单碱基分辨率的结合信号。同时引入大小匹配的 Input（SMInput）作为阴性对照，系统性压低背景。武汉瑞兴自主优化了 eCLIP 的 RNA 建库策略，提升两端接头连接效率、简化操作步骤，提高文库构建成功率。
CLIP 方法学源头：Yeo, G., Coufal, N., Liang, T. et al. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat Struct Mol Biol 16, 130–137 (2009). doi 10.1038/nsmb.1545。
交联位点在文库里留下可读的截断信号，RBP 结合位置达到单碱基分辨率，不必再靠峰区间中心去推测。对研究蛋白在特定碱基上的识别（如 m6A 阅读器在 DRACH motif 上的结合）尤其关键。
用大小匹配的 Input 样本作阴性对照：Input 与 IP 样本的 RNA 片段长度分布一致，能有效扣除实验流程本身带来的系统背景，让留下来的峰更接近真实结合事件。
瑞兴生物对建库步骤做了优化，减少反应与漂洗次数，提高两端接头连接效率和文库构建成功率；实验全程可提供 IP 前预实验，降低抗体不识别导致的空跑风险。
凡是能拿到合格 IP 抗体的 RBP 都可以做；细胞与组织均可送样，植物样本需提前沟通多糖多酚对 IP 的影响。可与 RNA-seq 数据联合，回答"结合了之后表达有没有变"。
eCLIP 的关键在于把"逆转录在交联位点终止"这个原本的缺陷变成信号。紫外交联让 RBP 与它结合的 RNA 形成共价键；裂解、片段化后用抗体免疫沉淀，RBP 带着结合位点附近的 RNA 片段一起被留下。
逆转录时，酶沿着 RNA 走到被交联蛋白挡住的位点就停下——这条 cDNA 的 3′ 端，恰好就是 RBP 在 RNA 上的结合位置。eCLIP 在这些中断 cDNA 的 3′ 端连一段单链 DNA adapter，再用逆转录引物与 adapter 引物扩增，把中断片段完整收进文库。测序后 reads 的 5′ 端在基因组上的分布，就是 RBP 结合位点的分布。
配套的 SMInput（size-matched input）对照取与 IP 样本片段长度一致的 Input 建库，用于估计每个位点"只是因为丰度高或片段偏好而被抓到的概率"，扣除后再调用结合峰。
活细胞 254 nm 紫外照射，RBP 与 RNA 形成共价键，固定瞬时互作
温和裂解保持 RBP-RNA 复合物完整，去蛋白酶抑制剂外的常规处理
限量 RNase 把 RNA 切成适合免疫沉淀的长度
靶蛋白抗体沉淀 RBP-RNA 复合物，洗涤去除非特异结合
按片段大小分离，回收目标区间，进一步压低背景
从胶条中回收 RNA，去除蛋白与染料
逆转录 + ssDNA adapter 连接 + PCR，构建测序文库
抗体是本项目最关键的一项——建议先提供抗体说明书或已有 IP/IF 数据，由我方评估后再下单。
| 样本类型 | 要求 | 说明 |
|---|---|---|
| 抗体 | IP 级 ≥40 µg 或按说明书（一般 ≥40 µL） | 需确认抗体能识别天然构象靶蛋白；不识别时建议换抗体或改做标签系统 |
| 细胞 | ≥1×10⁸ 个 | 活细胞状态良好、无污染；组织取目标区域，避免坏死与钙化部分 |
| 细胞干体积 | ≥100 µL | |
| 动物组织 · 心、脑、肾、肺 | ≥500 mg | 新鲜组织取样后立即液氮速冻，−80 ℃ 保存，干冰运输；避免反复冻融 |
| 动物组织 · 肝、脾、胃 | ≥500 mg | |
| 动物组织 · 皮肤、血管、软骨、骨等坚韧组织 | ≥1000 mg | |
| 植物组织 | ≥2 g | 选健康幼嫩组织；70% 酒精冲洗表面后液氮速冻，干冰运输 |
用增强型 CLIP 在全转录组范围稳健发现 RNA 结合蛋白结合位点
期刊：Nature Methods（IF 32.1，2024 JCR） · 发表时间：2016 年
阅读原文：doi.org/10.1038/nmeth.3810
研究发现：这是 eCLIP 的方法学论文。作者把原本会被丢弃的"逆转录在交联位点中断"的 cDNA 通过 3′ 端 ssDNA adapter 连接回收进文库，使交联位点成为可读信号；同时用大小匹配的 Input 作对照控制系统背景。在多个 RBP 上的重复实验显示，eCLIP 的信噪比和可重复性明显优于常规 CLIP，并已在 ENCODE 项目中用于大规模绘制人类 RBP 结合图谱。
RNA 与拓扑异构酶 I 相互作用以调节 DNA 拓扑结构
期刊：Molecular Cell（IF 16.6，2024 JCR） · 发表时间：2024 年
阅读原文：doi.org/10.1016/j.molcel.2024.07.032
样本与方法：人细胞系；作者将 eCLIP 测序与体外 RNA 结合实验结合，鉴定拓扑异构酶 I（TOP1）结合的 RNA。
研究发现：TOP1 能与 RNA 结合，且结合的 RNA 大部分是携带蛋白质合成信息的 mRNA。结合 DNA 超螺旋实验、单分子磁性镊子实验与测序分析，作者证明 RNA 与 TOP1 的催化活性相互拮抗，RNA 聚合酶 II 可激活转录过程。该研究首次把 TOP1 界定为 RNA 结合蛋白，提出"RNA 调节 TOP1 介导的 DNA 松弛"这一新机制，为理解转录中 RNA 与 DNA 的相互作用提供了新视角。
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