01
技术简介
在真核细胞中，遗传信息由染色质承载，其结构和功能的持续变化对基因表达控制至关重要。研究表明，非编码 RNA（ncRNA）在染色质重塑、组蛋白修饰与转录调控中起关键作用。要研究 lncRNA 怎么工作，先得把它和它的结合对象一起抓出来——这正是 ChIRP（Chromatin RNA Immunoprecipitation，染色质 RNA 纯化）解决的问题。
ChIRP 用一组覆盖目标 RNA 全长的反义寡核苷酸探针，在接近天然的状态下捕获目标 RNA，并连带沉淀与它结合的蛋白、DNA 和其他 RNA。按下游检测方式分为三个方向：
ChIRP-MS
检测与目标 lncRNA 结合的所有蛋白质
ChIRP-WB
验证目标蛋白质与目标 lncRNA 的结合
ChIRP-DNA-seq
检测与目标 lncRNA 结合的所有 DNA
ChIRP-RNA-seq
检测与目标 lncRNA 结合的所有 RNA
这套方法的应用面很广：定位 lncRNA 在染色体上的结合区域并鉴定其结合的蛋白复合物；解析 lncRNA 与染色质互作的机制（如 HOTTIP 通过结合非编码区调控 miRNA 基因座转录）；鉴定 RNA 在核内的功能位点，解析其在基因调控、细胞分化与发育中的作用；以及在癌症、神经退行性疾病中分析疾病相关 RNA 如何通过染色质互作影响疾病进展（如 lncRNA DBET 与 HOXDeRNA 分别影响膀胱癌与胶质瘤）。
02
技术优势
不受 RNA 二级结构影响
每隔 100 bp 设计一个探针，覆盖全长 RNA 分子。二级结构会把某些区段藏起来，全长覆盖的探针组保证每个区段都有探针可以结合，不会因为结构遮挡漏掉关键区域。
分组探针设计
所有探针分为奇数组（odd）与偶数组（even），分别进行下拉实验。两组结果互相印证，非特异结合不会在两组里同时出现，这是 ChIRP 控制假阳性的核心设计。
同时研究多种分子互作
同一份目标 RNA，可同时研究它互作的蛋白质、DNA 和 RNA。一次实验设计，三类分子一次说清，避免分开做导致的样本差异。
近天然状态捕获
甲醛交联固定后再杂交捕获，保留 RNA 在细胞内的结合状态与亚细胞定位信息，比体外重组体系更接近真实生理条件。
03
技术原理
ChIRP 的逻辑是"用探针把 RNA 从染色质里捞出来"。设计覆盖目标 RNA 全长的反义寡核苷酸探针（长度约 20 nt），探针 3′ 端标记生物素；甲醛交联把细胞内的 RNA-蛋白、RNA-DNA 相互作用固定住；超声把染色质打碎后，生物素探针与裂解液杂交，再用链霉亲和素磁珠捕获探针——目标 RNA 连同结合在它上面的蛋白、DNA 片段、其他 RNA 一起被拉下来。
洗脱后分三条路线检测：蛋白质走 WB 验证或质谱（ChIRP-MS）鉴定；DNA 提取后测序（ChIRP-DNA-seq）得到 RNA 在基因组上的结合图谱；RNA 提取后测序（ChIRP-RNA-seq）得到与该 RNA 互作的其他 RNA。
04
实验流程
1探针设计
设计反义寡核苷酸探针，长度 20 nt 左右，每隔 100 bp 覆盖全长
2细胞培养
ChIRP 实验需要约 2×10⁷ 细胞
3甲醛交联
细胞甲醛交联，固定 RNA-蛋白与 RNA-DNA 互作后收集
4超声打断
交联后的 DNA 与 RNA 超声破碎至适合杂交的长度
5探针杂交捕获
生物素标记的 lncRNA 探针与裂解液杂交，磁珠捕获复合物
6提取与分析
RNA、DNA 及核酸结合蛋白分别提取，进行下游检测与数据分析
ChIRP 原理：全长反义探针捕获目标 lncRNA，蛋白 / DNA / RNA 三类互作分别富集
05
样本要求
目标 RNA 的序列信息是启动项目的前提——探针设计需要完整序列，请在送样前一并提供。
| 样本类型 | 要求 | 说明 |
|---|
| IP 后 RNA | ≥10 ng（Qubit 定量） | 若实验室已完成部分实验，可提供 IP 后 RNA / DNA 直接建库，需提供定量结果 |
| IP 后 DNA | ≥5 ng（Qubit 定量） |
| 细胞 | ≥2×10⁸ 个 | 细胞状态良好、无污染；需提供目标 RNA 完整序列用于探针设计 |
| 细胞干体积 | ≥200 µL |
| 动物组织 · 心、脑、肾、肺 | ≥500 mg | 新鲜组织液氮速冻后 −80 ℃ 保存，干冰运输；目标 RNA 需在送样组织中表达 |
| 动物组织 · 肝、脾、胃 | ≥500 mg |
| 动物组织 · 皮肤、血管、软骨、骨等坚韧组织 | ≥1000 mg |
| 植物组织 | ≥2 g | 选健康幼嫩组织；70% 酒精冲洗表面后液氮速冻，干冰运输 |
选型提示：ChIRP 适合已知序列的 lncRNA 或 circRNA 研究，需要相对较大的细胞量（≥2×10⁸）。如果目标 RNA 丰度很低，或研究对象是 mRNA 的特定区域，建议先与技术顾问讨论是否改用 ChIRP 变体方案或 RNA pull-down + RIP 组合。完整版要求以最新版《送样规范》为准。
06
分析内容
标准分析 STANDARD
ChIRP-DNA｜质控与比对fastqc / trimmomatic / MultiQC；Bowtie2 比对统计；PCA 与样本相关性；reads 在 TSS 与基因上下游 3kb 的信号分布
ChIRP-DNA｜Peak 识别与注释MACS2 峰数量（含启动子区峰数）、峰长度分布；ChIPseeker 注释功能区域与距 TSS 距离；DiffBind 组内重叠
ChIRP-DNA｜富集与 Motif启动子区峰基因 GO 与 KEGG；HOMER 峰内 motif 富集
ChIRP-RNA｜质控与定位碱基质量、GC、有效长度、cDNA 文库代表性；比对与基因组区域分布、覆盖度、样本相关性与聚类
ChIRP-RNA｜结合峰分析ABLIRC 与 Piranha 双策略峰统计、峰宽度、峰基因组分布、双软件重叠、Motif、GO 与 KEGG
ChIRP-MS｜质谱鉴定MaxQuant 数据库检索；肽段长度分布、肽段数目分布、漏切位点分布与蛋白鉴定统计
高级分析 ADVANCED
三方向联合DNA 结合位点、RNA 互作谱与蛋白组叠合，交叉验证同一调控事件
与 RNA-seq 联合结合 × 表达变化，判断调控方向
组间差异结合不同处理条件下结合位点的变化
互作网络构建由目标 RNA 串起 DNA 位点与结合蛋白，画调控网络
亚细胞定位关联结合 FISH 定位解释互作的空间分布
07
应用案例
项目案例一
IF 15.7
Nature Communications · 急性肾损伤
The long non-coding RNA RSDR protects against acute kidney injury in mice by interacting with hnRNPK to regulate DHODH-mediated ferroptosis
长链非编码 RNA RSDR 通过与 hnRNPK 相互作用调控 DHODH 介导的铁死亡，保护小鼠免受急性肾损伤
期刊：Nature Communications（IF 15.7，2024 JCR） · 发表时间：2025 年 8 月
研究团队：武汉大学人民医院团队
我司支持：ChIRP-MS 捕获 RSDR 互作蛋白组、ChIRP-seq 解析染色质结合图谱、RNA-seq 与数据分析挖掘
阅读原文：doi.org/10.1038/s41467-025-62433-2
- 从两种 AKI 模型锁定肾脏特异性 lncRNA：建立顺铂诱导（Cis-AKI）与缺血再灌注（IRI）两种小鼠模型，肾脏高通量测序取交集得到 87 个共同差异表达 lncRNA，其中 XLOC_032768（命名为 RSDR）在 AKI 中显著下调且具有肾脏特异性，无编码潜力，主要定位于近端小管上皮细胞核。
- ChIRP-MS 直接锁定 hnRNPK：用 ChIRP-MS 筛选 RSDR 结合蛋白，RNA pull-down 与 RIP 验证互作；截短片段实验定位 RSDR 的 1–113 nt 与 227–339 nt 为结合关键区域，RSDR 通过结合 hnRNPK 的 KH3 结构域限制其核输出、维持核内水平。顺铂刺激导致 hnRNPK 核内减少，RSDR 过表达可逆转。
- ChIRP-seq 找到共同靶基因 DHODH：对 RSDR 过表达细胞做 RNA-seq 与 ChIRP-seq，结合 hnRNPK CUT&RUN 数据取交集，锁定 DHODH 为共同调控靶基因；两者结合 DHODH 启动子（TSS 附近）促进其转录，并提高启动子区 H3K27ac 与 H3K4me3 富集。
- lncRNA-蛋白-线粒体轴抑制铁死亡：AKI 中 DHODH 表达降低，其缺失加剧铁死亡。DHODH 通过把 CoQ 还原为 CoQH₂ 维持线粒体 redox 稳态、抑制脂质过氧化；RSDR 过表达恢复 DHODH 水平、降低铁死亡标志物，hnRNPK 敲除则进一步降低 DHODH。临床层面，69 例 AKI 患者尿液 RSDR 水平显著低于 84 例对照，诊断 AUC 0.7452（敏感性 72.46%、特异性 72.62%），提示其作为 AKI 无创标志物的潜力。
项目案例二
IF 6.2
Cell & Bioscience · 结直肠癌肝转移
LncRNA CRLM1 inhibits apoptosis and promotes metastasis through transcriptional regulation cooperated with hnRNPK in colorectal cancer
LncRNA CRLM1 通过转录调控与 hnRNPK 协同作用在结直肠癌中抑制细胞凋亡并促进转移
期刊：Cell & Bioscience（IF 6.2，2024 JCR） · 发表时间：2022 年
我司支持：ChIRP-seq、ChIRP-MS
阅读原文：doi.org/10.1186/s13578-022-00849-9
研究发现：研究通过分析公开转录组数据，筛选并确认与结直肠肝转移（CRLM）相关的 lncRNA。功能增减实验显示 CRLM1 能抑制 Balb/C 裸鼠 CRC 细胞凋亡并促进肝转移。作者用 RNA-seq、ChIRP、免疫荧光、qRT-PCR、Western blot 等手段研究分子机制，并识别了与 CRLM1 相互作用的蛋白质、DNA 和 RNA。结果显示 CRLM1 与参与细胞粘附和 DNA 损伤的基因染色质区域存在关联，且这种关联与其调控的前转移基因表达呈双向相关；CRLM1 与 hnRNPK 蛋白物理互作并促进其核定位，显著提高 hnRNPK 启动子占有率，共同调控一组转移基因的表达。
08
常见问题
ChIRP、RAP、ChART 都是研究 RNA-染色质互作的，怎么选？
三者思路相近，差别在捕获方式与通量。ChIRP 用短反义寡核苷酸探针（约 20 nt），不需要体外转录长探针，实验周期短、背景低，适合已知序列的 lncRNA；RAP 用体外转录的长反义探针，捕获效率高但探针制备复杂；ChART 依赖亲和纯化，需要构建报告系统。已知序列、想快速拿到蛋白 / DNA / RNA 三类互作，ChIRP 是性价比最高的选择。
odd 组和 even 组探针都要做吗？
建议都做。两组探针结合 RNA 上不同区段，如果某个信号只在单组出现，更可能是非特异结合而非真实互作；两组共同出现的信号才被认为是可信的结合位点。这也是 ChIRP 相比单组探针方法假阳性率更低的原因。
目标 lncRNA 丰度很低能做吗？
低丰度 RNA 的捕获效率会明显下降，需要相应提高细胞投入量（≥2×10⁸）。建议先提供 RNA-seq 或 RT-qPCR 的表达数据，我们评估丰度后决定是否直接做 ChIRP，或先用 RNA pull-down / RIP 做一轮筛选。
ChIRP-MS、ChIRP-DNA-seq、ChIRP-RNA-seq 可以分开做吗？
可以，三类互作可单选、二选或三选，按需组合。同一次捕获产物分三条路线检测，样本差异最小。若只关心蛋白互作，选 ChIRP-MS 加 WB 验证即可；若关心 RNA 调控哪些基因，ChIRP-DNA-seq 是核心。
项目周期多久？
CHIRP 为 6–8 周，若目标 RNA 序列需要先确认（如从公共数据拼接），探针设计阶段可能额外增加 1 周左右。
可以研究 circRNA 或 mRNA 吗？
可以。ChIRP 适用于任何有完整序列信息的 RNA，circRNA 的环化位点序列明确，同样能设计全长覆盖探针。对 mRNA 而言，如果关注的是特定区域（如 3′UTR）的互作，可只针对该区域设计探针组，能显著降低细胞量需求。
