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功能基因组 · 5′ 端转录起始

CAGE-seq 加帽端 mRNA 测序

同一个基因往往有多个转录起始位点，不同起始位点对应不同的 5′UTR，也就响应完全不同的上游调控信号。CAGE-seq 抓住 RNA 5′ 端的帽子结构，直接读出转录到底从哪里开始——不再靠推测启动子位置，而是实测每一个 TSS。

  • 全基因组 TSS 鉴定
  • 发现新启动子
  • sharp / broad 启动子分型
  • eRNA 检测
  • nanoCAGE 低起始量
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185,000+ TSS人类约 5 万个基因，已确认 TSS 超过 18.5 万个
RNA≥2 µg组织 ≥50 mg 起；nanoCAGE 起始量更低
eRNA可检出能检测通常双向低水平表达的增强子 RNA
Motif预测TSS 精确鉴定提升转录因子基序预测精度
01

技术简介

CAGE-seq（Cap Analysis of Gene Expression，加帽端 mRNA 测序）主要鉴定转录起始位点（TSS）。绝大多数基因有两个甚至两个以上的转录起始位点，不同的 TSS 会导致基因受到不同的上游非翻译区（5′UTR）调控——不同的 5′UTR 序列中可能包含截然不同的作用元件，起始位点不同，基因表达所响应的信号也完全不同。

同一个基因可能受不同启动子调控而导致表达差异，进而导致某些疾病的发生。CAGE-seq 可以对 mRNA 中所有的 TSS 进行鉴定，发现新的启动子，以及差异表达分析，还可以推测可能的转录因子结合位点以及基因表达的网络调控——这是通过加帽位点鉴定实现的。

CAGE-seq 原理：捕获 mRNA 5' 端帽子结构，直接测定转录起始位点
CAGE-seq 原理：捕获 5′ 帽结构，直接读取转录起始位点
02

技术优势

靶向 TSS 而非整个基因

通过靶向转录起始位点而不是整个基因，提供高度准确和详细的基因表达分析。据估计，人类基因组中大约有 50,000 个基因，但已确定的 TSS 超过 185,000 个，CAGE-seq 能够恢复大部分 TSS。

TSS 级别定量

基于每个 TSS 而不是每个基因的定量分析，可以发现 microarray 和 RNA-seq 无法检测到的差异表达基因——同一个基因总量没变、但启动子使用比例变了的情况，只有 TSS 级定量能抓到。

新基因无需芯片

不需要装载探针的 DNA 芯片，就可以对新基因进行分析。对注释不全的物种、新转录本发现尤其友好。

动态范围更宽

提供了更广泛的动态范围来分析高表达和低表达的基因，低丰度转录本同样能被定量。

eRNA 检测能力

能够检测通常双向低水平表达的增强子 RNA（eRNA），为增强子活性研究提供直接证据。

Motif 预测更准

TSS 的精确鉴定使转录因子结合基序的预测比 microarray 更好——知道转录从哪开始，才知道核心启动子在哪里。

03

技术流程

1

帽子结构捕获

利用 RNA 5′ 端特有的帽子结构进行捕获富集

2

逆转录与标签酶切

逆转录后通过标签酶切产生短 CAGE 标签

3

文库构建与测序

CAGE 标签建库，高通量测序获得 5′ 端序列

4

基因组比对

高质量序列比对到参考基因组，定位 5′ 端坐标

5

TSS 聚类注释

reads 5′ 端定义为精确 TSS，相邻 TSS 聚类为标签簇

6

启动子特征分析

启动子分型、motif 挖掘与差异使用分析

CAGE-seq 建库原理图
图 1：CAGE-seq 建库原理
04

样本要求

不建议直接寄送 RNA——CAGE 对 5′ 端完整性敏感，组织或细胞由我方统一提取质检更可控。

样本类型送样量说明
RNA（自行提取）≥2 µgA260/A280 1.8–2.2、浓度 ≥100 ng/µL、RIN ≥7；干冰运输
细胞≥2×10⁶ 个（干体积 ≥5 µL）TRIzol 充分裂解后 −80 ℃ 保存；勿用胰酶消化
动物组织 · 心、脑、肾、肺≥50 mg取新鲜组织，块尽量 ≤0.5 cm；预冷 PBS 或生理盐水洗去血迹，液氮速冻后 −80 ℃ 保存，干冰运输
动物组织 · 肝、脾、胃≥20 mg
动物组织 · 皮肤、血管、骨等坚韧组织≥100 mg
动物组织 · 节肢动物≥100 mg
植物组织≥200 mg选健康幼嫩组织；70% 酒精冲洗表面后液氮速冻 20 min 以上
真菌干体积 ≥20 µL提前沟通物种与培养条件
全血≥16 mL（可混样）紫头 EDTA 抗凝管采集，冰袋 2–8 ℃ 运输
免疫细胞干体积 ≥20 µL一般 10 µL 细胞干体积对应约 1×10⁶ 个细胞

CAGE 文库构建对 RNA 5′ 端完整性要求较高，样本 RIN 建议 ≥7；特殊物种如没有明显 28S 条带，可不以 RIN 为准，但 Agilent 2100 图基线需平整。完整版要求以最新版《送样规范》为准。

05

分析内容

标准分析 STANDARD

  1. 原始数据质控reads 质量、去接头、去污染（如 rRNA）
  2. 基因组比对高质量序列精准比对到参考基因组
  3. TSS 鉴定与聚类reads 5′ 端定义为 TSS，相邻 TSS 聚类为标签簇（TC）
  4. 注释与分布TSS / TC 关联基因注释，统计基因组区域分布
  5. 启动子分型按 TSS 分布宽度分为 sharp 与 broad 两类

高级分析 ADVANCED

  1. 核心启动子 motif挖掘 TSS 上下游保守顺式作用元件（如 TATA-box）
  2. 差异 TSS 使用分组间启动子使用比例比较，识别切换事件
  3. eRNA 检测鉴定增强子区双向低水平转录本
  4. 与 RNA-seq 联合TSS 级表达 × 基因级表达，解析启动子选择的功能后果
  5. 转录因子预测由 motif 富集推测结合该启动子的转录因子
06

应用案例

项目案例一
IF 6.9 Scientific Data · 大豆

Genome level identification of transcription start sites by nanoCAGE sequence in soybean

利用 nanoCAGE 测序技术在基因组水平鉴定大豆转录起始位点

期刊：Scientific Data（IF 6.9，2024 JCR）　·　发表时间：2025 年 10 月
研究团队：北京大学现代农业研究院
我司支持：nanoCAGE-seq 测序服务
阅读原文：doi.org/10.1038/s41597-025-06003-7

  • 首绘大豆全基因组 TSS 图谱：研究以大豆根与茎组织为材料，利用 nanoCAGE-seq（所需 RNA 样本量更少、更灵敏的 CAGE 升级版）直接捕获带 5′ 帽子的完整 mRNA 转录本，共精准鉴定 711,689 个 CTSS，聚类为 27,321 个标签簇（TC），对应 16,100 个基因。
  • 启动子以 sharp 型为主：在所有 TC 中 66.36% 为 sharp 型、33.64% 为 broad 型。这一比例与玉米类似而不同于拟南芥，提示启动子结构可能具有物种特异性。
  • TATA-box 在 −30 bp 显著富集：对核心启动子区（−50 至 +50 bp）做 motif 分析，在 TSS 上游约 30 bp（−35 至 −25 区间）显著富集 TA-rich motif，即经典 TATA-box；该 motif 在 46% 的 sharp 启动子与 40% 的 broad 启动子中出现。
  • 数据质量可验证：两个生物学重复间 Pearson 相关系数极高（根 0.98、茎 0.97）；CAGE 标签分布符合高质量数据特有的幂律分布；86.24% 的 CTSS 位于已知基因启动子区域；四个样本总体比对率 64%–71%。
项目案例二
IF 5.5 Genome Research · 灵长类大脑

Annotation and cluster analysis of spatiotemporal- and sex-related lncRNA expression in Rhesus macaque brain

长链非编码 RNAs 在灵长类大脑发育和老化过程中表达动态变化和作用

期刊：Genome Research（IF 5.5，2024 JCR）　·　发表时间：2017 年 7 月
实验材料：中国猕猴
我司支持：CAGE-seq、RNA-seq技术与数据分析支持
阅读原文：doi.org/10.1101/gr.217463.116

研究策略：中国科学院昆明动物研究所李家立、胡新天和郑永唐学科组与中国科学技术大学汪香婷课题组合作，以中国猕猴为对象，通过 RNA-seq 和 CAGE-seq 深度测序及分析，结合原位杂交与原代神经元系统的功能验证，解析 lncRNA 在大脑发育和老化过程中的动态变化特征。

研究发现：大脑特异性 lncRNA 呈现高度的区域、性别和年龄表达差异性，共发现 18 个不同的 lncRNA 和 14 个不同的 mRNA 表达模块；相对于 mRNA，猕猴脑特异性 lncRNA 在发育和老化过程中呈现更高的动态变化特征。利用 CAGE-seq 对 lncRNA 和 mRNA 启动子区域进行测序和分析，发现 lncRNA 的启动子区域变化比 mRNA 呈现更明显的性别差异和时空变化性状。进一步研究发现 lncRNA 与 mRNA 之间存在多重正相关和负相关调控关系，其中大脑皮层区域特异性表达的 lncRNA 与 mRNA 之间的负相关调控关系，对发育和老化过程中大脑皮层的结构和神经元功能变化具有重要调控作用。该结果为进一步理解灵长类动物复杂大脑结构和高级认知功能的表观调控基础提供了实验依据。

07

常见问题

CAGE-seq 和 RNA-seq 的定位差别是什么？
RNA-seq 用 oligo(dT) 从 3′ 端抓 RNA，回答"这个基因表达多少"；CAGE-seq 从 5′ 端帽子抓，回答"转录从哪里开始、用了哪个启动子"。两者互补：RNA-seq 给基因级定量，CAGE-seq 给 TSS 级分辨率。想知道启动子切换、5′UTR 异构体、eRNA，必须用 CAGE-seq。
sharp 和 broad 启动子有什么区别？
按 TSS 分布宽度划分。sharp 型有一个主导 TSS、分布集中，常与组织特异性调控相关；broad 型包含一系列紧密相邻的 TSS、分布分散，常与组成型或动态调控的基因相关。两者比例本身就是物种 / 组织特征，也是研究启动子演化与调控策略的切入点。
nanoCAGE 和标准 CAGE 怎么选？
nanoCAGE 是 CAGE 的升级版，所需 RNA 样本量更少、灵敏度更高，适合起始量有限的样本（如少量细胞、微量组织）。标准 CAGE 对 RNA 5′ 端完整性要求更高。项目案例中的大豆研究用的就是 nanoCAGE-seq。样本量紧张时优先考虑 nanoCAGE。
需要多少生物学重复？
差异 TSS 使用分析建议每组至少 3 个生物学重复，与 RNA-seq 要求一致。只做 TSS 图谱普查、启动子特征描述时，每组 2 个重复即可（项目案例中即为每个组织 2 个重复，重复间相关性 r>0.97）。
植物样本能做吗？
可以，送样规范中植物组织 ≥200 mg。植物样本需注意多糖多酚对 RNA 提取的影响，建议选健康幼嫩组织、70% 酒精冲洗表面后液氮速冻。项目案例中的大豆根与茎研究即为植物应用实例。
能同时得到基因表达量吗？
CAGE 标签本身携带定量信息，可以给出 TSS / TC 水平的表达量，并与 RNA-seq 数据联合分析，解析"启动子使用比例变化"如何转化为基因表达变化。若需要完整的基因级差异表达与功能富集，建议 CAGE-seq 与 RNA-seq 配套设计。
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