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Multi-omics in situ Pairwise sequencing

靶向空间组 MiP-seq

空间组学分两条路：一条靠测序捕获全转录组，视野大但分辨率受限、重构出来是二维马赛克；另一条靠成像看原位信号，分辨率高但多数只能做靶向。MiP-seq 走的是后一条——用双条形码锁式探针加双端测序，在亚细胞、单碱基分辨率上同时把 DNA、RNA、蛋白和功能小分子放到同一张切片里看，还能做真正的三维图谱。

  • 亚细胞分辨率
  • 单碱基分辨
  • RNA + 蛋白共检
  • 三维空间图谱
  • 宿主—微生物双组
  • 靶标全定制
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10N双条码解码能力（传统单条码为 4N）
56–96%靶标检测效率（相对 HCR3.0-smFISH）
~50%测序与成像成本、时间节省
4类分子DNA / RNA / 蛋白 / 功能小分子同片共检
01

技术简介

靶向空间组学技术，具有高灵敏度、高特异性以及高分辨率等特性，可实现单碱基和亚细胞分辨率的基因定性与定量检测。

技术服务目前包含低通量基因的组织细胞精准定位、单细胞空间图谱绘制、三维空间图谱构筑、RNA / 蛋白共检、宿主—微生物双重空间组分析等等。该技术将空间组学与单细胞测序联合应用，可实现高分辨的单细胞空间图谱构建，是单细胞测序、空间组下游验证必备工具。广泛适用于临床和科研领域，助力生命科学研究与临床精准诊断。

和"测全转录组"类空间技术相比，靶向路线的取舍很直白：不追求一次把所有基因都测出来，而是把注意力压在你关心的那几十到几百个靶标上，用更高的分辨率和更高的检测效率把它们看清楚。对已经有明确候选基因、需要做原位验证的课题，这条路线的性价比通常更高。

技术来源：MiP-seq（multi-omics in situ pairwise sequencing，多组学原位双端测序）由华中农业大学曹罡教授与戴金霞副研究员团队开发，原始方法论文发表于 Nature Biomedical Engineering（2024, 8(7):872–889，IF 26.7），doi.org/10.1038/s41551-024-01205-7。该成果已实现产业转化。
02

技术原理

MiP-seq 的核心是两个设计：双条形码锁式探针和双端测序。先说锁式探针是什么——它是一段两端能和靶标序列互补的线性 DNA，只有当两端都精确对上目标时，连接酶才会把它闭合成环；成环之后才能进行滚环扩增，把信号放大成一个在显微镜下看得见的亮点。对不上就闭不了环，也就没有信号，这是它能做到单碱基分辨的原因。

双条码和双端测序解决的是"轮数"问题。传统原位测序每条探针只带一个条形码，一轮读一个碱基，解码能力是 4N（4 种荧光染料、N 轮测序）；MiP-seq 每条探针带两个条形码，一轮同时读两个，解码能力提到 10N。解码通量上去之后，测同样多的靶标需要的轮数明显减少，成像时间短了，光毒性也随之下降，成本和测序时间大约能省一半。

① 探针设计与杂交

设计锁式探针、引物与检测探针，靶向目标分子；探针与靶标 RNA 在 37 ℃ 下杂交过夜。

② 连接成环

用 SplintR 连接酶做特异性连接，形成滚环扩增模板。只有两端完全匹配才闭合成环——这一步决定单碱基特异性。

③ 滚环扩增（RCA）

30 ℃ 扩增 2 小时，把单个识别事件放大成可成像的信号点。

④ 双端测序与解码

采用双端成对测序策略，每一轮同时解码两个条形码碱基对；每一轮结束后用高灵敏显微成像记录荧光信号。

⑤ 序列稀释策略

光信号拥挤是所有基于成像的空间组学都会遇到的瓶颈。MiP-seq 用一组测序引物和锚定基因引物分批读取，把密集信号拆开，便于高密度信号的精确解析。

⑥ 图像分析

用深度学习辅助的成像分析方法，对多轮测序图像做配准、解码和细胞分割，最终还原成带坐标的多组学图谱。

蛋白怎么测？思路是把抗体接上一段核酸，再用锁式探针去识别这段核酸。这样 RNA 和蛋白走同一套生化反应体系，才可能在同一张切片上同时出结果——包括神经递质这类功能小分子。

03

技术优势

单细胞、单分子、单碱基分辨率

不只是"细胞级"。MiP-seq 可达到单核苷酸分辨率，用于检测 DNA 和 RNA 的单碱基突变与单核苷酸多态（SNP），还能区分 RNA 的 m6A 修饰。小鼠海马中亲代基因的等位基因空间特异性表达模式，就是靠这个精度解析出来的。

解码通量高，轮数少

双条形码锁式探针 + 双端测序策略，解码能力 10N vs 4N，所需测序轮数显著减少，成像时间缩短、光毒性降低，测序与成像成本、时间约节省 50%。

检测效率高

与现有原位测序方法相比，探针设计策略与生化反应体系显著提高了检测效率。在单个细胞中对 GAPDH、MTOR 等基因的检测效率达到 HCR3.0-smFISH 的 96%，方法整体报道的靶标检测效率区间为 56%–96%。

同一张切片，多模态共检

以亚细胞分辨率同时描绘同一切片中 DNA、RNA 和蛋白质的空间景观以及神经递质的空间分布；已实现弥漫性大 B 淋巴瘤组织样本中 30 种蛋白与 6 种 mRNA 的同步空间定位。

  • 特异性强、灵敏度高、应用范围广泛
  • mRNA、miRNA、lncRNA、snRNA 均可检测
  • 剪切变体、SNP 检测全覆盖
  • 基因组合自由、靶标全定制化
  • 各类物种、器官全覆盖
  • 冰冻、石蜡、细胞、新鲜、"上古"样本均可
  • RNA / 蛋白一网打尽
  • 可与拉曼成像、活体 Ca²⁺ 成像整合，把表达谱与功能活性对上
04

技术流程

1

靶标设计

按课题确定基因 / 蛋白组合，设计双条形码锁式探针与引物

2

样本制备

细胞爬片、冰冻切片或石蜡切片，固定与通透处理后上样

3

杂交与连接

探针 37 ℃ 杂交过夜，SplintR 连接酶特异性连接成环

4

滚环扩增

30 ℃ RCA 2 小时，把识别事件放大成可成像信号点

5

双端测序与成像

多轮双端测序 + 荧光成像，序列稀释策略拆分拥挤信号

第 5 步之后进入图像分析：深度学习辅助的多轮图像配准、条形码解码与细胞分割，输出带空间坐标的多组学表达矩阵。流程参数整理自原始方法论文（Nature Biomedical Engineering, 2024）；实际项目中的探针设计与反应条件会按靶标面板和样本类型调整。

05

技术应用

01 · 低通量的基因原位检测

单细胞、空间组的必备验证。当你从单细胞测序或空间转录组里筛出几个候选基因，下一步要证明"它确实在这个位置、这个细胞里表达"，原位检测就是这一步的工具。

MiP-seq 低通量基因原位检测结果：目标基因在组织切片中的原位信号定位
靶基因原位信号定位
MiP-seq 原位检测与组织形态对照：信号点与细胞结构叠加
原位信号与组织形态对照

02 · 单细胞空间图谱绘制

联合单细胞测序，以低成本方式产生高分辨的组织空间图谱。思路是：先用 scRNA-seq 把细胞类型和标志基因定下来，再用 MiP-seq 把这些标志基因原位"投"回组织，得到的图谱既有单细胞分辨率，又不用对每个样本都做全转录组空间测序。

MiP-seq 联合单细胞测序绘制组织单细胞空间图谱：细胞类型空间分布
细胞类型空间分布
MiP-seq 空间图谱：标志基因表达与区域分区结果
标志基因表达与区域分区
MiP-seq 与单细胞测序联合分析流程与对应关系示意
与单细胞测序的对应关系

03 · 三维空间图谱

告别马赛克二维平面空间组，构建全组织的三维基因表达图谱，探索基因在三维空间的表达模式。两条实现路径：

  • 连续或间断切片，多张 2D 图像空间对准，最终实现三维重构
  • 整组织透明检测，荧光显微镜深度成像逐层扫描，实现整组织三维空间图谱解析
MiP-seq 三维空间图谱：连续切片重构的三维基因表达图
连续切片空间对准 → 三维重构
MiP-seq 整组织三维图谱：逐层扫描得到的基因表达三维分布
整组织逐层扫描三维图谱

04 · RNA-蛋白多维空间组

在同一张切片上，同时检测基因和蛋白的空间位置信息和相互作用关系。蛋白通过抗体偶联核酸、再由锁式探针识别来实现检测，因此和 RNA 走同一套反应体系，不用分两张片子去做配准。

MiP-seq RNA 与蛋白共检：同一张切片上基因与蛋白的空间分布叠加
同片 RNA + 蛋白共定位
MiP-seq 多维空间组：RNA 与蛋白信号的相关性与相互作用分析
RNA–蛋白信号相关性分析

05 · 宿主—微生物双重空间组

在同一张切片上，同时解析微生物和宿主基因的空间表达信息和相互作用关系。方法论文中已实现在 PK-15 细胞共感染模型里，同步检测 8 个细胞因子 / 趋化因子基因的 mRNA 与 2 种病毒特异蛋白（CSFV E2、PCV2 Cap）。

MiP-seq 宿主-微生物双重空间组：宿主基因与微生物靶标在同一张切片上的空间分布
宿主基因与微生物靶标同片定位
06

样本要求

项目要求说明
兼容样本类型核心细胞样本（爬片 / 涂片）、新鲜组织、冰冻组织、石蜡（FFPE）切片方法论文中明确验证过细胞样本、冰冻样本与石蜡样本；新鲜样本按要求速冻处理后同样适用
存档样本支持长期存档样本（含"上古"样本）可用年限与靶标类型、保存状态有关，立项前建议先做小样本预实验评估
RNA 靶标类型mRNA、miRNA、lncRNA、snRNA剪切变体、SNP 检测全覆盖；可区分 RNA m6A 修饰
DNA / 蛋白靶标DNA 位点、蛋白（抗体偶联核酸方式）同一张切片可与 RNA 同步检测；多重蛋白需提前确认抗体适用性
物种与器官各类物种、器官全覆盖靶标序列已知即可设计探针；非模式物种需提供靶标序列信息
靶标数量基因组合自由、靶标全定制化常规为几十至数百个靶标；具体通量按探针设计与成像轮数确定
送样与运输由技术顾问在立项时按样本类型与靶标面板确认细胞爬片、冰冻切片、石蜡切片的固定与运输条件各不相同，建议先确认再寄送
关于靶标设计：MiP-seq 的检测效果高度依赖探针设计，靶标面板一旦确定就要开始设计探针和引物。建议在项目沟通阶段就把"必看"和"可看"的靶标分两档列出来——必看的放进主面板，可看的作为备选，避免在探针已经合成之后再来回调整。
07

分析内容

标准分析 STANDARD

  1. 多轮图像配准跨轮次漂移校正，信号点对齐到统一坐标
  2. 条形码解码与质控逐点解码、信噪比过滤、阴性探针背景评估
  3. 细胞分割细胞核 / 细胞膜标记辅助分割，信号归属到细胞
  4. 空间表达定量按细胞 / 区域统计靶标拷贝数与阳性率
  5. 分组差异统计不同区域、不同处理组间的靶标丰度比较

高级分析 ADVANCED

  1. 细胞类型注释与空间邻域标志基因映射细胞类型，邻域富集与互作分析
  2. RNA–蛋白共定位同一细胞内 RNA 与蛋白信号的共表达与相关性
  3. 三维重构连续切片对准或整组织逐层扫描，构建 3D 表达图谱
  4. 宿主–微生物共定位微生物靶标与宿主基因的空间邻接与互作
  5. 联合 scRNA-seq / 空间转录组把原位结果映射回已有多组学图谱
08

文献案例

案例一
食管鳞癌 ANLN · Pol II 相分离与靶基因表达

Nuclear ANLN regulates transcription initiation related Pol II clustering and target gene expression

细胞核 ANLN 蛋白调控转录起始相关的 RNA 聚合酶 II 聚集和靶基因表达

期刊：Nature Communications（IF 15.7）　·　发表时间：2025 年 2 月
阅读原文：doi.org/10.1038/s41467-025-56645-9

ANLN 与 Pol II 调控靶基因表达研究的整体研究设计与主要结果概览图
研究设计与主要结果概览

研究背景

食管鳞癌（ESCC）中的 Anillin（ANLN）是一种有丝分裂蛋白，异常高表达可促进 ESCC 发生，但对其深层分子调控机制了解不足，本研究致力于探究这一问题。

研究内容

1. ANLN 与转录调控关系的发现：在不同癌细胞中发现核内 ANLN 与染色质及新生 RNA 共定位，推测其参与基因转录调控。通过多种实验证实 ANLN 与 RNA 聚合酶 II（Pol II）大亚基直接互作，且二者在基因组上共定位并形成核内转录凝聚体。ANLN 调控 Pol II 的聚集和液–液相分离，通过其无序区特定序列与 Pol II 互作促进 Pol II CTD 相分离。

2. ANLN 对基因表达的影响：敲降 ANLN 会降低 Pol II 活性，减弱增强子和超级增强子信号，调控特定基因表达。结合 RNA-Seq 和 CUT&Tag 技术，筛选鉴定出 ANLN–Pol II 轴的直接靶基因，这些基因多受超级增强子调控，ANLN 与 Pol II 及多种转录因子结合于超增强子区域。

3. MiP-seq 技术的验证：利用单细胞分辨率空间多组学技术（MiP-seq）对特定靶基因和蛋白的空间位置进行验证，观察到在典型原癌基因 CCND1 和 TXNRD1 的启动子及增强子区域，ANLN 蛋白与其协同空间定位。ANLN 蛋白主要与靶基因共表达，而非管家基因，表明 ANLN 介导的基因转录具有基因特异性。

MiP-seq 验证结果：ANLN 蛋白与 CCND1、TXNRD1 靶基因位点在细胞核内的协同空间定位
MiP-seq 原位验证：ANLN 蛋白与 CCND1 / TXNRD1 位点协同定位
09

常见问题

MiP-seq 和空间转录组（Stereo-seq / Visium HD）是什么关系？
是两条路线，不是替代关系。空间转录组靠测序捕获全转录组，胜在"无偏倚"——不需要预先知道看哪个基因；MiP-seq 是靶向路线，只测你指定的靶标，胜在分辨率（亚细胞、单碱基）和检测效率，还能同时看 DNA、蛋白和小分子。常见做法是先用空间转录组或单细胞测序筛候选，再用 MiP-seq 做原位验证。
一次能检测多少个靶标？
基因组合是自由定制的，常规量级是几十到数百个靶标。上限取决于探针设计的复杂度、成像轮数和信号密度——解码能力是 10N，所以轮数比传统单条码方案少很多。具体能做多少，建议在立项时把靶标清单交给技术顾问，按面板复杂度一起定。
石蜡样本能做吗？
可以。方法论文中验证过细胞样本、冰冻样本和石蜡样本三类；长期存档样本也在适用范围内。存档样本的可用年限和靶标类型、保存状态有关，建议先做小样本预实验评估再铺开。
蛋白和 RNA 能同时看吗？
能，而且是在同一张切片上。蛋白这边把抗体接上一段核酸，再用锁式探针去识别这段核酸，所以和 RNA 走同一套生化体系，不用分两张片子做配准。方法论文中已实现弥漫性大 B 淋巴瘤样本里 30 种蛋白与 6 种 mRNA 的同步空间定位。
能做三维吗？
能，两条路径：一是连续或间断切片，把多张 2D 图像做空间对准后重构三维；二是整组织透明处理，荧光显微镜深度成像逐层扫描，直接得到整组织的三维图谱。选哪条取决于组织大小、透明化难度和成像深度。
能做微生物和宿主一起看吗？
能。宿主—微生物双重空间组是 MiP-seq 的应用场景之一，在同一张切片上同时解析微生物和宿主基因的空间表达与相互作用。方法论文里已在 PK-15 细胞共感染模型中，同步检测 8 个细胞因子 / 趋化因子基因的 mRNA 与 2 种病毒特异蛋白（CSFV E2、PCV2 Cap）。
能看突变和 RNA 修饰吗？
可以。MiP-seq 达到单核苷酸分辨率，能检测 DNA 和 RNA 的单碱基突变与 SNP，也能区分 RNA 的 m6A 修饰；剪切变体同样在覆盖范围内。小鼠海马中亲代基因的等位基因空间特异性表达模式，就是靠这个精度解析出来的。
项目周期一般多长？
周期由探针设计、样本制备和成像轮数三部分决定。靶标面板确定后需要先做探针设计与合成；样本到位后进入杂交、连接、RCA 和多轮测序成像；最后是图像分析与交付。具体排期请与技术顾问按靶标数量和样本数确认。
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