技术简介
16S rRNA 基因编码原核生物核糖体小亚基（30S）的 RNA，长约 1,500–1,550 bp，结构上是保守区与 9 个高变区（V1–V9）交替。保守区参与核糖体的结构与催化功能，受到很强的纯化选择，在远缘类群之间也高度相似，因此可以设计跨类群的通用引物；高变区承受的选择压力小，累积的突变反映了系统发育距离，提供分类信号。
这个设计带来一个关键能力：不需要预先知道样本里有什么，就能把几乎所有细菌／古菌的目标片段扩出来。传统培养法只能回收环境微生物中极小的一部分，而扩增子测序覆盖了绝大多数不可培养的类群。流程上就是：提取总 DNA → 用带 barcode 的融合引物 PCR 扩增目标高变区 → 建库上机 → 测序 reads 经质控、拼接、去噪后得到 ASV（或 OTU）→ 与数据库比对做物种注释 → 做多样性与差异分析。
两个必须写进方法学的边界。一是分辨率天花板：主流短读长只覆盖基因的一段，通常能稳定到属水平，种级鉴定不可靠——很多"某菌种与疾病相关"的结论都踩在这个坑上。二是 16S 拷贝数（GCN）在基因组之间差异很大（E. coli K-12 有 7 个拷贝），拷贝数高的类群会被系统性放大、低的会被压缩，这直接污染相对丰度与多样性指标的解读。此外 16S 基因存在水平转移，也会推高多样性估计。
技术优势
单样本成本最低，撑得起大队列
相比宏基因组，扩增子每样本成本通常低一个数量级。做几十到几百例的临床或生态队列时，这是唯一能跑得动的方案，也是先做普查再挑子集深入（two-tiered 设计）的标准做法。
流程成熟，跨研究可比
从引物、建库到 DADA2／QIIME2 分析都有公认做法。ASV 是 100% 相似度的精确序列，不同批次、不同研究之间可以直接比较——这是 OTU 路线做不到的。
能同时覆盖细菌与古菌
前提是用对引物。经典 Klindworth 版 V3–V4 引物对古菌覆盖仅约 0.3%，如果研究对象涉及产甲烷菌、氨氧化古菌，标准方案几乎等于漏检，需要换成 Zymo 版 V3–V4 或 V4。
高拷贝，低生物量样本也测得出来
16S 在多数细菌基因组里是多拷贝的，加上 PCR 放大，皮肤拭子、活检这类微生物量极低的样本也能建库。代价是这类样本最容易被试剂和环境里的背景 DNA 干扰，必须配空白对照。
分析体系完整，统计方法可选
α／β 多样性、PERMANOVA 组间检验、LEfSe／ANCOM-BC2 差异物种、PICRUSt2 功能预测、共现网络、随机森林，都是现成模块，分析口径可在方案中写清楚。
与多组学衔接方便
同一批样本可以并行做宏基因组、代谢组或宿主转录组；扩增子负责"谁在那里"，其它组学负责"在做什么"，组合起来才是完整的故事。
技术流程
采样与保存
多点混合成生物学重复，液氮或 −80 ℃ 速冻，严禁反复冻融。
DNA 提取
机械珠磨 + 化学裂解双重破壁，去除腐殖酸等抑制剂。
核酸质检
Qubit 定量 + 凝胶／Agilent 2100 查完整性与纯度。
PCR 扩增
带 barcode 的融合引物，高保真酶，循环数控制在低位。
纯化与建库
磁珠纯化去引物二聚体，定量后等摩尔混池。
文库质检
查片段分布与浓度，掺入 PhiX 内标后上机。
上机测序
Illumina 双端，V3–V4 常用 2×300，V4 常用 2×150。
生信分析
质控去噪 → ASV → 注释 → 多样性与差异分析。
送样要求
样本类型差异很大，下面给的是起点。低生物量样本（组织、血液、空气滤膜）请务必提前沟通，并同时准备空白对照。
| 样本类型 | 送样量建议 | 处理与保存 | 提示 |
|---|---|---|---|
| 粪便 / 肠道内容物 | ≥200 mg，1–2 g 更稳妥 | 无菌冻存管，液氮速冻后 −80 ℃；干冰运输 | 避免接触尿液与马桶水；取样后尽快冷冻 |
| 土壤 / 沉积物 | ≥5 g | 过筛去根系与石块，−80 ℃ 或干冰 | 需去除腐殖酸、多酚等 PCR 抑制剂 |
| 水体 | 过滤后 0.22 µm 滤膜 | 记录滤水量，滤膜 −80 ℃ 保存 | 浑浊水体建议分级过滤 |
| 拭子 口腔 / 皮肤 / 鼻腔 | 专用采样拭子，每部位 1 支 | 拭子头折断入管，−80 ℃ | 采样前记录是否进食、刷牙、用药 |
| 组织 / 活检 | ≥50–100 mg | 去除血液与内容物，−80 ℃／干冰 | 宿主 DNA 占比常极高，评估后决定是否去宿主 |
| 发酵液 / 培养物 | 菌体 ≥10⁷ 细胞 | 离心收菌，去除培养基成分 | 说明培养条件与取样时间点 |
| 已提取 DNA | 总量 ≥30–50 ng，浓度 ≥5–20 ng/µL | −20 ℃ 或 −80 ℃，干冰运输 | OD260/280 在 1.8–2.0；注明提取试剂盒 |
不同项目在样本量、保存液、运输方式上会有差异，实际要求以最新版本送样规范和项目方案为准。
文献案例
| 期刊 / 年份 | 研究 | 与 16S 相关的要点 | DOI |
|---|---|---|---|
| Nature Communications 2017 |
女性生殖道微生物连续体及其与子宫相关疾病的关系 Chen C, et al. |
对 110 名育龄女性生殖道 6 个部位（阴道下 1/3、后穹窿、宫颈管、宫腔、输卵管、盆腔液）做 16S 测序，打破了"上生殖道无菌"的传统认知；结果显示沿解剖结构呈渐进性变化，且宫颈管样本与盆腔液显著相关，提示可用易取得的宫颈粘液评估上生殖道菌群。 | 10.1038/s41467-017-00901-0 |
| Science 2018 |
全球土壤优势细菌图谱 Delgado-Baquerizo M, et al. |
覆盖六大洲 237 个地点，用 16S rRNA 基因扩增子测序刻画全球土壤细菌组成，发现真正占优势的细菌类群只占全部类群的很小一部分，全球土壤细菌多样性由少数优势类群主导。 | 10.1126/science.aap9516 |
常见问题
选 V3–V4 还是 V4？
能鉴定到种吗？
相对丰度能不能说明"某菌变多了"？
功能预测结果能直接写进文章吗？
为什么一定要设阴性对照？
样本要送多少重复？
和宏基因组测序怎么选？
数据库要写进方法吗？
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