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互作组 · 蛋白-蛋白互作

Co-IP-MS 免疫共沉淀联合质谱

想知道一个蛋白在细胞里和谁搭档，最直接的办法是把它"抓"出来，看带下来了谁。Co-IP 用靶蛋白抗体在近生理条件下做免疫共沉淀，质谱负责把沉淀物里每一个蛋白鉴定出来——已知互作可以验证，未知结合蛋白可以直接筛出来，最后用 WB 收口确认。

  • 近生理条件捕获
  • 未知互作蛋白筛选
  • 质谱鉴定 + WB 验证
  • 互作组富集分析
  • 组织 / 细胞 / IP Beads
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IP 抗体≥40 µg免疫沉淀级抗体，或按说明书用量
≥6×10⁷ 细胞组织送样量见送样表；也接收 IP 后 Beads
6–9周样本合格后含 IP 实验与质谱报告
WB可选配套对候选互作蛋白做一对一验证
01

技术简介

Co-IP（免疫共沉淀）是研究蛋白质互作的经典方法：用靶蛋白的特异性抗体，把细胞内的靶蛋白连同与它结合的蛋白一起"拉"下来，再鉴定沉淀物里有什么。它的价值在于测的是细胞内的真实互作——蛋白在裂解前已经形成复合物，不是体外重组出来的。

Co-IP-MS 在这基础上接了质谱：沉淀物酶解后做 LC-MS/MS 蛋白鉴定，一次实验就能得到与靶蛋白结合的一整组蛋白，而不是只验证事先猜好的那一个。对已知互作，它给出直接证据；对未知结合蛋白，它提供候选清单。

实际项目里的典型问法是："我的目标蛋白和谁一起干活？""这个表型是不是因为互作伙伴变了？"——前者用 Co-IP-MS 筛候选，后者比较不同处理组之间的互作蛋白组差异。

02

技术优势

互作真实可查

在近生理条件下完成捕获，蛋白复合物在裂解前已经形成，反映的是细胞内的真实结合状态，而不是体外孵育的产物。相比酵母双杂交等遗传学方法，更接近体内实况。

蛋白可信度高

质谱基于肽段序列鉴定蛋白，不依赖抗体特异性——只要肽段质量数够、数据库完整，鉴定结果就可追溯。每个蛋白都有唯一肽段支撑，避免"抗体交叉反应带来的假互作"。

一次拿到一组互作蛋白

不必逐个猜互作对象。沉淀物里的全部蛋白一次性鉴定，直接给出候选复合物成员名单，再结合功能富集判断这批蛋白集中在哪些通路上。

可与 WB 配套验证

质谱给出"可能互作"的清单，WB 用对应抗体做一对一确认，两步组合既保证覆盖面又保证单个结果的可信度。可同步比较不同处理组，观察互作关系是否随条件改变。

03

技术原理

实验分两段。第一段是免疫共沉淀：把靶蛋白抗体挂在 Protein A/G 磁珠上，与细胞裂解液孵育，抗体抓住靶蛋白，靶蛋白连同结合在它上面的伙伴蛋白一起被磁珠带到管底；洗掉未结合的杂蛋白后，沉淀物里剩下的就是"靶蛋白 + 与它结合的蛋白"。

第二段是质谱鉴定：沉淀物经还原烷基化、胰酶酶解成肽段，液相色谱分离后进入质谱，采集二级碎裂谱图，与蛋白数据库比对得到肽段-蛋白对应关系。质谱不依赖抗体，因此不会漏掉"没想到要检测"的蛋白。

需要说明的是，Co-IP 捕获的是直接或间接结合在同一复合物里的蛋白——两个蛋白可能并不直接接触，而是通过第三个成员连在一起。要区分直接结合，需要补体外重组蛋白结合实验或交联类方法。

Co-IP-MS 技术原理
Co-IP-MS 技术原理图
04

实验流程

1

抗体-磁珠偶联

靶蛋白抗体与 Protein A/G 磁珠孵育结合，洗去未结合抗体

2

细胞裂解

温和裂解液裂解细胞，保持蛋白复合物完整，离心取上清

3

免疫共沉淀

裂解液与抗体-磁珠孵育，靶蛋白连同互作蛋白被捕获

4

洗涤洗脱

严格洗涤去除非特异结合，低 pH 或竞争洗脱获得沉淀物

5

酶解与 LC-MS/MS

沉淀物酶解为肽段，液相分离后质谱采集二级谱图

6

数据检索与富集

数据库检索鉴定蛋白，剔除常见背景蛋白，做功能富集

对照怎么设：建议同时做三个对照——① 空白磁珠对照（不加抗体）扣除磁珠非特异吸附；② 同型 IgG 对照扣除抗体非特异结合；③ 若研究处理效应，加一组未处理/野生型对照，比较互作蛋白组的差异。
05

实测数据

实测结果展示

Co-IP-MS 实测结果展示图一：免疫共沉淀联合质谱项目的结果图（引自原站实测数据栏）
Co-IP-MS 实测结果展示（一）
Co-IP-MS 实测结果展示图二：免疫共沉淀联合质谱项目的结果图（引自原站实测数据栏）
Co-IP-MS 实测结果展示（二）
06

样本要求

如果实验室已经自己做完 IP，直接寄 IP 后的干 Beads 也可以，取 3/4 Beads 送样。

样本类型要求说明
抗体IP 级 ≥40 µg 或按说明书（一般 ≥40 µL）需能识别天然构象靶蛋白；同型 IgG 由我方配套准备
细胞≥6×10⁷ 个活细胞状态良好、无污染；组织取目标区域，避免坏死与钙化部分
细胞干体积≥60 µL
动物组织 · 心、脑、肾、肺≥300 mg新鲜组织液氮速冻后 −80 ℃ 保存，干冰运输；避免反复冻融
动物组织 · 肝、脾、胃≥300 mg
动物组织 · 皮肤、血管、软骨、骨等坚韧组织≥500 mg
植物组织≥1 g选健康幼嫩组织；70% 酒精冲洗表面后液氮速冻，干冰运输
IP 后 Beads取 3/4 干 Beads自行完成 IP 的样本：去掉 PBS，保留干 Beads 送样
纯化蛋白常规 ≥50 µg，最少 ≥10 µg如直接提供蛋白溶液，请同步提供浓度与纯度信息
08

应用案例

项目案例
IF 15.4 Cell Death & Differentiation · 成骨分化

MACF1 promotes osteoblast differentiation by sequestering repressors in cytoplasm

MACF1 通过在细胞质中隔离抑制因子促进成骨细胞分化

期刊：Cell Death & Differentiation（IF 15.4，2024 JCR）　·　发表时间：2021 年
我司支持：Co-IP-MS 蛋白互作鉴定、转录组测序与 ChIP-seq 技术服务
阅读原文：doi.org/10.1038/s41418-021-00744-9

研究背景：成骨细胞分化是一个受时空遗传程序调控的动态过程，细胞骨架蛋白除参与细胞骨架组装外，也同时调控 Wnt、Hedgehog、MAPK 等多条信号通路。微管微丝交联因子 MACF1 是一种多结构域细胞骨架蛋白，广泛参与细胞骨架组装、细胞迁移、增殖与分化。

研究发现：该研究首次发现 MACF1 通过影响成骨分化相关转录因子在细胞中的定位来调控成骨细胞分化。为锁定 MACF1 的互作蛋白，课题组对 MACF1 敲低前后的样本做了 Co-IP-MS：共有 5 个蛋白（ACTB、CDK12、HIST1H4A、MEAF6、VIM）在敲低组与对照组中均被检出，提示它们与 MACF1 存在稳定互作。对两组互作蛋白做富集分析显示，对照组互作蛋白主要富集于 filament 及细胞外基质相关通路，而敲低 MACF1 后则主要富集在 nucleus 通路——互作格局的改变直接对应了 MACF1 对转录因子核质分布的调控作用。

09

常见问题

Co-IP-MS 和 GST pull-down 怎么选？
Co-IP 用内源抗体在细胞裂解液里捕获，反映的是体内已经形成的复合物，可以是直接也可以是间接互作；GST pull-down 用体外重组的诱饵蛋白，适合确认两个蛋白是否直接结合、并定位结合结构域。常见的组合是先用 Co-IP-MS 筛候选，再用 pull-down 加截短体验证直接结合。
没有 IP 级抗体，能做吗？
可以变通。① 若靶蛋白有标签（GFP、Flag、HA、Myc 等），用标签抗体做 IP，稳定性通常更好；② 若确实没有可用抗体，可改用内源过表达稳系加标签 IP。需要提前构建细胞模型，周期要单独算。
为什么质谱结果里总有一些"常见背景蛋白"？
角蛋白、热休克蛋白、肌动蛋白、核糖体蛋白等在任何样本里都大量存在，容易在裂解和操作中混入。我们用磁珠空白对照和同型 IgG 对照把这些背景扣除，只保留在 IP 组特异出现的蛋白。若您已有明确的排除清单（如某些高丰度管家蛋白），可一并提供。
需要多少生物学重复？
建议每组至少 2 个生物学重复，便于区分"稳定互作"与"偶然带入"。若只做单组互作蛋白鉴定、不做组间比较，1 个 IP + 1 个 IgG 对照也可以启动，但统计意义有限。
项目周期多久？
CoIP-MS 为 6–9 周，提供 IP 与质谱报告。抗体购买一般额外 1–2 周；若需追加 CoIP 后的 WB 检测，按单项另行约定。
组织样本和细胞样本有区别吗？
组织样本需先匀浆裂解，某些组织的细胞外基质和脂肪会影响裂解效率，因此送样量要求比细胞高（心脑肾肺、肝脾胃 ≥300 mg，坚韧组织 ≥500 mg）。若靶蛋白在特定细胞类型中表达，建议先做免疫组化确认表达定位，避免样本里几乎没有靶蛋白导致 IP 空跑。
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