技术简介
扩增子测序的原理没变：用通用引物把标记基因扩出来，测它的序列变异和丰度。变的是能测多长。16S rRNA 基因全长约 1,500 bp，由 10 个保守区与 9 个高变区（V1–V9）交替构成；Illumina 双端 300 bp 只能覆盖其中一到两个区（V3–V4 约 465 bp），而 Oxford Nanopore（ONT）长读长测序不受片段长度限制，一条 read 就能穿过整条基因。
三个标记基因的分工是明确的：16S 看细菌与古菌，18S 看真核微生物（原生生物、藻类、真菌以外的微真核类群），ITS 看真菌。ITS 位于核糖体 RNA 转录单元内部（18S–ITS1–5.8S–ITS2–28S），长度在类群间差异很大，真菌物种鉴定用它比用 18S 分辨力高得多。
| 标记 | 目标类群 | 全长产物 | 常用引物 / 区段 |
|---|---|---|---|
| 16S | 细菌、古菌 | 约 1,500 bp | 27F AGRGTTYGATYMTGGCTCAG ／ 1492R RGYTACCTTGTTACGACTT（覆盖 V1–V9） |
| 18S | 真核微生物 | 约 1,800 bp | SSU rRNA 全长引物对；短读长常只测 V4 或 V9 |
| ITS | 真菌 | 约 500–700 bp（类群间差异大） | ITS1–ITS4，覆盖完整的 ITS1–5.8S–ITS2 |
ITS 这条要多说一句。二代也能测 ITS，但通常只测 ITS1 或 ITS2 中的一个，而这两个区段的类群偏好是相反的——某些真菌类群在 ITS2 引物下几乎扩不出来。测全长等于把两个区段的信息同时拿到，避免单区引物偏倚把整个类群从结果里抹掉。
技术优势
属水平持平，差异全在种一级
Esberg 等 2024 年 npj Biofilms and Microbiomes 用 ONT 全长 16S（过滤后平均 1,540 bp）与 Illumina V3–V4（388 bp）平行测了 407 份唾液样本，并用 39 株口腔标准菌株验证：属水平两个平台全部判对，种水平 ONT 92%、Illumina 74%。Illumina 判错的 10 株里有 7 株集中在 Streptococcus、Schaalia、Veillonella 这几个近缘属——正是 V3–V4 变异位点不够的典型表现。
能拿到可命名的物种，而不是"未分类"
同一项研究中，ONT 检出 131 个属、499 个种／系统型，Illumina 为 116 个属、409 个种（覆盖率仅 82%）；更关键的是核心种（100% 样本均检出）ONT 有 30 个，Illumina 只有 3 个。做 biomarker 或组间差异物种时，这个差距直接决定结论能不能写。
ASV 单碱基分辨率，跨研究可复用
全长数据配合 DADA2 去噪得到 ASV（扩增子序列变异），是精确序列而非 97% 聚类的近似。不同批次、不同研究之间可以直接比较合并，结果能长期复用。
近缘种不再被误判
同属物种在单个高变区上可能只差一两个碱基，短读长分不开。全长序列积累的分类信息多一个量级，对低丰度、序列高度相似的类群尤其明显。
一次实验覆盖细菌、古菌、真菌
16S、18S、ITS 三个标记可以按研究目的一次规划。做土壤、水体、发酵体系这类真核与原核微生物都重要的样本，不必分两次送样。
通量弹性大，设备可以从实验室搬到现场
ONT 走纳米孔电流信号单分子测序，上机后实时出数，看到数据够了就能停；通量可按需在 MinION 与 PromethION 之间伸缩，单张芯片从几十 Mb 到上百 Gb。对于需要就地测序的样本——野外采样、临床即时检测、生物安全三级（BSL-3）实验室——MinION 这类桌面设备目前没有替代品。
技术流程
湿实验和二代扩增子是同一套逻辑，差别在两个地方：扩增的是整条基因（对 DNA 完整性和聚合酶要求更高），以及建库与上机走三代平台。
采样与对照
多点混合成生物学重复，液氮或 −80 ℃ 速冻，严禁反复冻融。同步设置提取空白。
DNA 提取
机械裂解（锆珠）+ 化学裂解双重破壁，尽量保留长片段。
去除抑制剂
土壤／沉积物重点去腐殖酸与多酚，否则全长扩增效率明显下降。
质检定量
Qubit 荧光定量 + 凝胶或 Agilent 2100 确认主带完整。
全长 PCR
带 barcode 的融合引物一步扩增，20–25 个循环，高保真长片段酶。
纯化与质检
磁珠纯化去引物与短片段，确认目标条带（16S 约 1.5 kb）。
建库上机
ONT 连接法或条码试剂盒建库，按通量需求选择 PromethION 或 MinION 上机，可实时监控产出。
碱基识别
用 Dorado 高精度（HAC）或超高精度（SUP）模型解码；需要更高单条准确率时可启用 Duplex 模式。
送样要求
全长扩增对 DNA 完整性的敏感度高于二代扩增子：短读长只要求几百 bp 的模板能扩出来，全长要求整条约 1.5 kb 的模板完整无损。DNA 降解是本方案最常见的失败原因。
| 样本类型 | 送样量建议 | 处理与保存 | 提示 |
|---|---|---|---|
| 粪便 / 肠道内容物 | ≥200 mg | 无菌管，液氮速冻后 −80 ℃；干冰运输 | 宿主 DNA 比例低，是最容易做的类型 |
| 土壤 / 沉积物 | ≥5–10 g | 过筛去根系与石块，−80 ℃ 或干冰 | 腐殖酸抑制明显，务必充分去除 |
| 水体 | 滤膜 1–3 张 | 0.22 µm 或分级滤膜，记录滤水量；−80 ℃ | 生物量低，建议同步送现场空白 |
| 组织 / 拭子 / 体液 | 个案评估 | −80 ℃／干冰 | 宿主 DNA 占比可能很高，先评估再定 |
| 已提取 DNA | 总量 ≥1 µg，浓度 ≥20 ng/µL | −80 ℃，干冰运输，避免反复冻融 | 主带需 ≥10 kb 且无明显降解；OD260/280 在 1.8–2.0，无色无沉淀 |
文献案例
一篇是方法学的头对头比较，一篇是全长 16S 与宏基因组联用在临床课题里的应用，一篇是种级生物标志物的发现，一篇展示了就地测序的可行性。四篇均由 Oxford Nanopore 平台完成。
| 期刊 / 年份 | 研究 | 与全长扩增子相关的要点 | DOI |
|---|---|---|---|
| npj Biofilms and Microbiomes 2024;10:149 |
唾液菌群的全基因 16S ONT 测序与 Illumina MiSeq 测序比较 Esberg A, et al. |
ONT 全长 16S（过滤后平均 1,540 bp）与 Illumina V3–V4（388 bp）平行测 407 份健康成人唾液样本。模拟群落中 Emu 配合 eHOMD 数据库可 33/33 全部正确鉴定到种、read 准确率 95.8%。39 株口腔标准菌株的验证结果是属水平两平台全部判对，种水平 ONT 92%、Illumina 74%；Illumina 判错的 10 株中 7 株为 Streptococcus、Schaalia、Veillonella 的近缘种。ONT 检出的属数（131 vs 116）、种／系统型数（499 vs 409）与 Chao1、Shannon 丰富度均更高。这项研究用大样本量支撑了一个结论：长读长的增益不在群落结构判断，而在种及以下的分辨力。 | 10.1038/s41522-024-00634-1 |
| Scientific Reports 2025;15:26486 |
Nanopore 全长 16S 测序提升细菌生物标志物发现的物种分辨率 Aja-Macaya P, et al. |
以结直肠癌（CRC）生物标志物发现为场景，对 123 名受试者的粪便同时做 Illumina V3–V4（DADA2 + QIIME2）与 ONT V1–V9（R10.4.1 化学 + Dorado，Emu 分类），并比较了 fast／hac／sup 三种碱基识别模型与 SILVA、Emu 默认库两套数据库。结果显示：属水平两平台丰度相关性良好（R² ≥ 0.8），但只有 ONT 能给出种级标志物——Parvimonas micra、Fusobacterium nucleatum、Peptostreptococcus stomatis、Bacteroides fragilis 等。基于这些物种做机器学习预测 CRC，14 个种的 AUC 为 0.87，仅用 4 个种仍有 0.82。作者同时指出一个陷阱：换用小而全的 Emu 默认库后种级注释率会虚高到接近 100%，属"过度自信"误判，不能当作真实注释率引用。 | 10.1038/s41598-025-10999-8 |
| Gut 2024;73(3):485-495 |
肠道菌群预测急性胰腺炎严重程度并揭示新代谢标志物 Ammer-Herrmenau C, et al. |
用 Nanopore 全长 16S rRNA 基因测序结合宏基因组测序，调查与急性胰腺炎（AP）严重程度直接相关的微生物组特征。发现 AP 患者口腔与直肠微生物组相对健康对照发生显著改变，且改变程度与住院时间、死亡率等临床特征相关；研究确定了 16 个与疾病严重程度相关的差异物种，功能分析提示重症 AP 的短链脂肪酸生成增加。文章证明口腔–肠道微生物组变化可用于预测 AP 的临床关键特征。 | 10.1136/gutjnl-2023-330987 |
| Scientific Reports 2024;14 |
基于 ONT 的全长 16S rDNA 测序揭示猕猴肠道–咽部菌群与结核的关联 Sawaswong V, et al. |
用 ONT 平台对食蟹猴肠道与咽部样本做全长 16S（V1–V9）测序，流程为 27F／1492R 扩增 → 条码 PCR → MinION 上机 → Guppy 超高精度模式碱基识别 → NanoCLUST 聚类与抛光 → RDP 注释。展示了长读长扩增子在生物安全三级（BSL-3）场景下、以小型设备完成菌群分析的完整可行性——对需要就地测序、不便外送的样本类型是典型用例。 | 10.1038/s41598-024-53880-w |
常见问题
全长还是 V3–V4，到底怎么选？
ONT 的准确率到底是多少？为什么有的资料写 99%，有的写 99.9%？
一个样本需要多少条 read？
ASV 还是 OTU？
全长 16S 能鉴定到菌株吗？
测出来的相对丰度能当绝对量用吗？
样本需要多少重复？
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