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FOXN3是一种转录抑制因子，SIN3A是ER+细胞（雌激素受体阳性细胞）中的一种抑制因子复合物，本文作者通过研究FOXN3的病理学功能机制，发现FOXN3这种转录因子与SIN3A会发生蛋白质之间的互相作用，并且这种互作需要由乳腺癌细胞中的雌激素诱导产生的NEAT1（一种Long noncoding RNAs）的参与。为了研究介导FOXN3和SIN3A复合体互相作用的RNA，使用了iRIP-seq技术（生命之美自主开发的技术，基于RIP-seq的改进版）最终通过两种数据分析方法（Piranha和CIMS）筛选出两种lncRNA，NEAT1和MALAT1（图2A和2B），然后再通过对NEAT1和MALAT1敲除和过表达后进行CoIP检测的方法确定了NEAT1是FOXN3和SIN3A互作所必需的（图2C）。在小鼠体内实验证实FOXN3-NEAT1-SIN3A复合物促进癌细胞肺转移（图2D）。
采用miR-31基因敲除(31-KO)和C57BL/6J野生型小鼠构建对乙酰氨基酚(APAP)诱导的DILI模型。采用小鼠原代肝细胞和小鼠肝细胞系 (AML-12)进行体外实验。通过Ago 2相关RNA免疫沉淀结合高通量测序来识别miR-31的特异性靶点。
RNA免疫沉淀结合高通量测序的生物信息学分析发现，JNK信号上游分子细胞分裂周期蛋白42 (Cdc42)是miR-31的特异性靶点，可形成miR-31/Cdc42/磷酸化混合谱系激酶3 (p-MLK3)负反馈环，限制JNK过度活化。
方法描述：碱基质量值是衡量测序质量的重要指标，碱基质量（Q）与测序错误率（P）密切相关，受测序仪状态，测序试剂质量，样本特性等的影响。质量值计算公式如下：
方法描述：对测序reads中四种碱基的分布比例进行评估，检查是否存在AT、CG分离现象，理论上A与T、C与G的含量在整个测序反应中分别相同，且维持 在稳定水平。
方法描述：去掉index序列、建库平衡用随机碱基及截取掉后面低质量的碱基后，我们用获得的clean reads进行有效长度分析。
方法描述：如果PCR扩增过度，文库中会含有大量序列完全相同的reads。为了保证文库更好代表原始DNA的丰度，本公司在建库中对PCR扩增循环有严格控制。
PCR duplication level计算方法为：从测序数据中随机挑选20万reads作为Total Reads，按照如下公式进行计算：
PCR duplication level=Duplication reads/ Total reads
方法描述：在这部分分析中，我们将有效测序数据（clean reads）比对到参考基因组上。
方法描述：将clean reads比对到参考基因组上，统计各个区域的分布情况，统计结果如下：
方法描述：CLIP-seq reads随转录单元长度的覆盖强度分析，以距转录起始位点和转录终止位点为标准，把cDNA平均分成100份，每一份称为一个bin，求落在每个bin中的reads平均数之和，从而得到每个bin上整体的reads覆盖度。
方法描述：把基因平均分成100份，每一份称为一个bin，求落在每个bin中的reads平均数之和，从而得到每个bin上整体的reads覆盖度。
方法描述：CLIP-seq reads随转录单元长度的覆盖强度分析，将基因的5’UTR, CDS, 3’UTR各平均分成100份，每一份称为一个bin，求落在每个bin中的reads 平均数之和，从而得到每个bin上整体的reads覆盖度。
reads在转录起始位点，转录终止位点，起始密码子和终止密码子附近的分布
方法描述：分别以转录起始位点/转录终止位点，翻译起始密码子/终止密码子为原点，统计其上下游1kb范围内reads的分布情况。
方法描述：统计落在每个gene上的reads数目，计算每个gene的RPKM值，然后通过比较同一个gene在两个样本中的RPKM值得到两个样本间的相关性。IP 项目中，如果实验与对照样本间相关性系数高，则说明两个样本中大部分reads在染色体上的分布情况类似，暗示实验样本结合的RNA/DNA的富集程度和特异性较低。
方法描述：在这部分分析中，根据样本相关性系数进行样本间聚类分析
方法描述：因为每个基因的表达量不同，定位在基因组一个位置上的CLIP-seq序列的多少无法评估该RNA结合蛋白在该位置上是否特异性结合。如何剔除基因表达量对RNA结合蛋白特异性结合信号带来的噪音，是分析CLIP-seq数据的一个关键点。MIT的Phillip A Sharp（因发现基因剪接获得过诺贝尔 奖获）实验室2009年一篇论文利用exon array转录本丰度作为参考，来消除表达量对AGO2蛋白所特异结合的mRNA位点的干扰(Chi, Zang et al.
2009)。理论依据是：转录本丰度低的mRNA在IP过程中被RNA结合蛋白抓下来的几率小，反之亦然。
方法一：ABLIRC
我们要求用于分析的单位置比对序列（unique mapped read）彼此之间需要互相重叠，重叠区域至少为1nt。对选定的基因，根据定位到此基因的reads产生随机序列，对此基因进行模拟定位500次，找出500次中最大的随机序列高度(p-value<0.01)作为背景，如果此基因中最大的peak高度< 最大的随机序列高度，则认为该peak为noise，将其去除；反之，则将该peak保留为结合峰。
方法二：Piranha
根据测序深度和覆盖度选取某一固定长度（xx nt）为单位（bin）将基因组等分，统计每个bin中的reads数目。模拟数据中reads的分布情况，来作为背景噪音，然后基于zero truncated negative binomial (ZTNB) 来寻找reads分布显著高于背景的位置。在此过程中每个bin都会获得一个p-value，根据p-value进行显著性筛选，得到真实的结合峰(Uren, Bahrami-Samani et al. 2012)。
方法描述：本项目使用上述策略，以input样本为背景，对实验样本的rmdup reads进行Peak Calling，得到实验样本特异的结合峰（peak）并进行统计，结果如下：
方法描述：对实验样本特异的结合峰的宽度进行统计，得到结果如下：
方法描述：统计结合峰在参考基因组上各个区域的分布情况，统计结果如下：
方法描述：维恩图主要展示两次重复实验之间重叠的peak的数目。
方法描述：我们用HOMER (Hypergeometric Optimization of Motif EnRichment)对实验样本特异的结合峰进行motif分析
方法描述：
1. 利用blast将参考基因组的基因序列比对到Gene Ontology数据库，进行GO注释；
2. 提取比对结果，作为背景即background；
3. 根据结合峰相关基因（peak associated gene）注释信息，统计每个基因所在的GO Term，根据每个Term的基因数目，以及背景中此Term 的基因数目，用超几何分布检验分析每个Term的显著性。
4. 选取排名前10的GO Term及其校正p-value和百分比图进行展示。
方法描述：
1. 利用blast将参考基因组的基因序列比对到KEGG数据库，进行KEGG注释；
2. 提取比对结果，作为背景即background；
3. 根据结合峰相关基因（peak associated gene）注释信息，统计每个基因所在的KEGG pathway，根据每pathway的基因数目，以及背景 中此pathway的基因数目，用超几何分布检验分析每个pathway的显著性。
4. 选取排名前10的pathway及其校正p-value和百分比图进行展示。
RNA结合蛋白（RBPs）参与到了转录后调控，包括RNA的可变剪接，RNA的空间折叠，从而导致RNA的表达量的变化。因此精确确定RBPs在RNA上的结合位置和结合特点是至关重要的。目前已经有成功解析RBP结合位点的方法，如CLIP-seq。但CLIP-seq也有很多的缺陷：如实验复杂，成功率低，文库的丰富度不够。和CLIP-seq比较类似的RIP-seq，虽然少了一些步骤，但获得的结果和CLIP-seq比较类似。最近有一项研究报道，使用DO-RIP-seq技术，也可以成功地获得RBPs的结合位点。而且能够获得更好的丰富度，这为RIP-seq分析RBPs的结合位点提供了方案和依据。
慢性阻塞性肺部疾病（Chronic obstructive pulmonary disease, COPD）是一种复杂，削弱肺部功能的疾病，主要临床和病理表现包括从气道炎症（慢性支气管炎），肺组织破坏（肺气肿）小气道重塑等（1,2）。COPD的发病机制至今仍然不明确，但是它涉及到肺部对香烟烟雾（cigarette smoke, CS）的异常炎症和细胞反应失调（1）。目前研究表明吸烟和遗传是COPD最大的危险因素（3）。本文作者之前通过对人类全基因组进行全基因组关联分析（genome-wide association studies， GWAS）确定IRP2（也称为IREB2）是COPD的主要候选基因（4-6），此后作者证明IRP2蛋白在COPD患者的肺部含量增加（4）。已有的研究表明IRP2基因位于人类15q25染色体上，该染色体上还包括编码烟碱乙酰胆碱受体的几个部件的基因。此外 GWAS分析表明15q25还与肺癌，外周动脉疾病和尼古丁成瘾相关（7-10）。铁调节蛋白（The iron-regulatory proteins, IRPs）IRP1和IRP2尤其是IRP2负责调节哺乳动物体内细胞铁离子的平衡（11）。IRPs在十二指肠，脊髓和中枢神经扮演非常重要的生理角色，同时IRPs也可能是肺动脉高压和神经性病变等疾病发病原因（12-15）。在细胞内铁耗尽的情况下，IRPs通过与位于mRNA上铁体内平衡基因的铁反应元件（iron-response elements, IREs）结合，导致其翻译被抑制从而降低铁的储存并同时增加铁摄取（12,15）。但是IRP2在肺部的生理功能以及IRP2的mRNA转录还不是很清楚，同时IRP2在肺部暴露在香烟烟雾中COPD发病的响应机制也不是很明确。因此，作者试图通过将COPD实验中小鼠模型和人COPD数据整合，阐述由香烟烟雾引起的COPD中IRP2的功能。
Sm 蛋白是一类高度保守RNA结合蛋白家族，广泛存在于生物界中。Sm蛋白在真核生物中由七个亚基组成，呈环状结构，能与相关的RNAs结合形成RNP（ribonucleoprotein，核糖核蛋白）。
