RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀）技术介绍

RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助发现miRNA的调节靶点。RIP技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP是染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同（如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等）。RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq），将RIP与新一代测序技术结合起来，在基因组范围内发现与蛋白或蛋白复合物相结合的RNA。

实验原理

★用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。

★防止非特异性的RNA的结合。

★免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。

★结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。

实验流程
生命之美的优势

★拥有标准化操作实验室和高通量测序技术平台，质量可靠。

★拥有Illumina HiSeq 2500、MiSeq等多种高通量测序平台。

★技术人员经验丰富，可以根据合作伙伴要求提供实验方案、解决实验问题、分析实验结果。

★拥有专业的生物信息团队和大型计算机，可以为合作伙伴提供个性化的生物信息分析服务。

应用领域

★研究肿瘤发生和转移中microRNA失调的有力工具。

肿瘤转移中miRNA调控的信号通路（Nicoloso et al. Nature Rev Cancer 2009）。在癌症恶化过程中，通常表达上升的miRNA以红色方框表示，而表达下降的miRNA以灰色方框表示。有助于上皮细胞-间充质转化的蛋白编码基因以绿色方框表示。EMT：epithelial-mesenchymal transition，上皮细胞-间充质转化；ECM：extracellular matrix，胞外基质。

送样要求

★对于组织样品

1. 样品总量：≥ 5g。

2. 样品保存：新鲜的样品先在液氮中速冻，-80℃保存，干冰运输。

3. 样品包装：我们建议使用1.5ml离心管装载样品，并且用封口膜密封。请在各样品管上做好清楚的标识，最好写在标签纸上，贴在管壁。

★对于细胞样品

1. 样品总量：≥500ul干体积。

2. 样品保存：培养好的细胞用预冷PBS漂洗三次，收集的细胞在液氮中保存，干冰运输。

3.样品包装：我们建议使用1.5ml离心管装载样品，并且用封口膜密封。请在各样品管上做好清楚的标识，最好写在标签纸上，贴在管壁。

我们的服务内容

我们为VIP客户提供从实验设计，样品制备，测序，数据挖掘，到科学问题解析的整体方案。

参考文献

Baroni TE, Chittur SV, George AD, Tenenbaum SA (2008) Advances in RIP-chip analysis: RNA-binding protein immunoprecipitation-microarray profiling. Methods Mol Biol 419, 93-108.

Chen HH, Lebon J, Riggs AD (2008) Analysis of RNA structure and RNA-protein interactions in mammalian cells by use of terminal transferase-dependent PCR. Methods Mol Biol 488, 319-41.

Hieronymus H, Silver PA (2003) Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery. Nature Genet 33, 155-161.

Schuettengruber B, Chourrout D, Vervoort M, Leblanc B, Cavalli G (2007) Genome regulation by polycomb and trithorax proteins. Cell 128, 735-745.

Terzi LC, Simpson GG (2009) Arabidopsis RNA immunoprecipitation. Plant J 59, 163-168.

Zhao J, Sun BK, Erwin JA, Song JJ, Lee JT (2008) Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science 322, 750-756.

CLIP-seq技术介绍

CLIP-seq (crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing)，紫外交联免疫沉淀结合高通量测序，可以高通量研究RNA结合蛋白在体内与众多RNA靶标的结合模式，并揭示其在一些重要生物学过程中的功能，是一项在全基因组水平揭示RNA分子与RNA结合蛋白相互作用的革命性技术。最近，这项技术也被应用到microRNA靶标鉴定等工作中。

建库流程图
分析流程图
详细分析流程

4.1 数据基础分析：

  1. 测序质量分析；
  2. 测序有效长度分析；
  3. cDNA文库的代表性分析。

4.2 全基因组定位分析：

  1. Reads与参考基因组比对分析；
  2. Reads在基因组不同区域分布情况；
  3. Reads的Rfam分类分析；
  4. Reads在gene/mRNA区分布分析；
  5. Reads在转录起始位点（TSS）附近的分布分析；
  6. Reads在转录终止位点（TTS）附近的分布分析；
  7. Reads在翻译起始位点（Start codon）附近的分布分析；
  8. Reads在翻译终止位点（Stop codon）附近的分布分析。

4.3 CLIP-seq高级分析：

在这部分分析中，我们开发的分析策略为：In silico random IP（仅使用unique reads进行分析，见图3）。对选定的基因中，根据定位到此基因的observed tag number with observed length产生随机序列，对此基因进行模拟定位500次，找出500次中maximal random tag height (p_value<0.01)，如果此基因中observed max peak height<max random tag height, 则被过滤掉该；反之，会被保留为鉴定出的peak。

4.4 高级分析主要包括：

  1. 基因组上结合峰（peak）分布情况；
  2. 结合峰的峰宽分析；
  3. 结合峰的峰间距分析；
  4. IP样本特异结合峰（specific peak）分析（与对照样本相比较）；
  5. 结合基序（motif）分析；
  6. 结合峰所在基因分析；
  7. 结合峰所在基因的GO分类分析；
  8. 结合峰所在基因的功能聚类分析（DAVID）;
  9. 结合峰所在基因的GO富集性分析;
  10. 结合峰所在基因的KEGG分析。
分析结果展示

Fig 4. Unique Mapped reads distribution across TSS and TTS

Fig 5. Unique Mapped reads distribution across Start codon and Stop codon.

Fig 6. Statistics of the length of the identified peaks.

Fig 7. Distance between peaks.

Fig 8. Peak location in genes/mRNA normalized to 100% in length.

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