技术简介

RIP-seq技术介绍

RIP技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀)，是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工 具，能获得RBP的调控靶点，同时也能帮助发现miRNA的调节靶点。RIP技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP是染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同(如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等)。RNA免疫共沉淀测序(RIP-seq)，将RIP与新一代测序技术结合起来，在基因组范围内发现与蛋白或蛋白复合物相结合的RNA。

产品优势

RIP-seq研究的是自然状态下最原始的RBP和RNA的互作状态，捕获到的RNA未经酶切片段化，获得的RNA片段较长，也无需RBP切胶纯化步骤，操作流程简单，成功率高，但是不能得到RBP直接结合的RNA位点。
我司也自主研发了iRIP-seq（improved RIP-seq）技术，其整合了RIP-seq操作的简洁性和CLIP-seq识别RNA结合位点的优势，可以高效探测RBP直接和间接 的RNA 结合位点。在该项技术中，我们取消了凝胶纯化和 RNP 标记步骤，并保留了 CLIP操作的其他步骤，改进了文库构建的方法。

实验原理

·用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。
·防止非特异性的RNA的结合。
·免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。
·结合的RNA序列通过microarray(RIP-Chip)，定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。

iRIP-seq实验操作流程

案例解析

案例1

FOXN3是一种转录抑制因子，SIN3A是ER+细胞（雌激素受体阳性细胞）中的一种抑制因子复合物，本文作者通过研究FOXN3的病理学功能机制，发现FOXN3这种转录因子与SIN3A会发生蛋白质之间的互相作用，并且这种互作需要由乳腺癌细胞中的雌激素诱导产生的NEAT1（一种Long noncoding RNAs）的参与。为了研究介导FOXN3和SIN3A复合体互相作用的RNA，使用了iRIP-seq技术（生命之美自主开发的技术，基于RIP-seq的改进版）最终通过两种数据分析方法（Piranha和CIMS）筛选出两种lncRNA，NEAT1和MALAT1（图2A和2B），然后再通过对NEAT1和MALAT1敲除和过表达后进行CoIP检测的方法确定了NEAT1是FOXN3和SIN3A互作所必需的（图2C）。在小鼠体内实验证实FOXN3-NEAT1-SIN3A复合物促进癌细胞肺转移（图2D）。

FOXN3结合RNA的RIP-seq数据分析结果展示

 FOXN3结合RNA的RIP-seq数据分析结果展示，及实验验证结果展示

案例解析

案例2

采用miR-31基因敲除(31-KO)和C57BL/6J野生型小鼠构建对乙酰氨基酚(APAP)诱导的DILI模型。采用小鼠原代肝细胞和小鼠肝细胞系 (AML-12)进行体外实验。通过Ago 2相关RNA免疫沉淀结合高通量测序来识别miR-31的特异性靶点。
RNA免疫沉淀结合高通量测序的生物信息学分析发现，JNK信号上游分子细胞分裂周期蛋白42 (Cdc42)是miR-31的特异性靶点，可形成miR-31/Cdc42/磷酸化混合谱系激酶3 (p-MLK3)负反馈环，限制JNK过度活化。

 通过Ago2 RIP-seq获取miR-31的靶标mRNA。

（A）Ago2 RIP-seq流程图。（B）miR-31靶标筛选策略。（C）RIP-seq中Ago2结合Cdc42的peak峰图。（D）APAP诱导DILI模型小鼠中，miR-31敲除后促进Cdc42的表达。（E）APAP诱导DILI细胞模型中，miR-31敲除后促进Cdc42的表达。（F）APAP诱导DILI模型小鼠中，JNK上游信号通路中p-MLK3和p-MLK4表达上调。（G）APAP诱导DILI细胞模型中，转染miR-31的inhibitor后，p-JNK以及JNK上游信号通路中p-MLK3和p-MLK4表达上调。（H）双荧光素酶报告基因实验验证miR-31与Cdc42靶向关系。（I）APAP诱导DILI细胞模型中，敲低Cdc42后p-JNK表达下调。（J）将I中细胞进行流式检测细胞坏死情况。

miR-31通过下调Cdc42抑制APAP诱导DILI肝细胞ROS/JNK/线粒体的过度激活的分子调控机制模型图。

文章导读

CELF1 preferentially binds to exon-intron boundary and regulates alternative splicing in HeLa cells

CELF1 preferentially binds to exon-intron boundary and regulates alternative splicing in HeLa cells

2017-09-07

RNA结合蛋白（RBPs）参与到了转录后调控，包括RNA的可变剪接，RNA的空间折叠，从而导致RNA的表达量的变化。因此精确确定RBPs在RNA上的结合位置和结合特点是至关重要的。目前已经有成功解析RBP结合位点的方法，如CLIP-seq。但CLIP-seq也有很多的缺陷：如实验复杂，成功率低，文库的丰富度不够。和CLIP-seq比较类似的RIP-seq，虽然少了一些步骤，但获得的结果和CLIP-seq比较类似。最近有一项研究报道，使用DO-RIP-seq技术，也可以成功地获得RBPs的结合位点。而且能够获得更好的丰富度，这为RIP-seq分析RBPs的结合位点提供了方案和依据。

Mitochondrial iron chelation ameliorates cigarette smoke–induced bronchitis and emphysema in mice

2016-05-30

慢性阻塞性肺部疾病（Chronic obstructive pulmonary disease, COPD）是一种复杂，削弱肺部功能的疾病，主要临床和病理表现包括从气道炎症（慢性支气管炎），肺组织破坏（肺气肿）小气道重塑等（1,2）。COPD的发病机制至今仍然不明确，但是它涉及到肺部对香烟烟雾（cigarette smoke, CS）的异常炎症和细胞反应失调（1）。目前研究表明吸烟和遗传是COPD最大的危险因素（3）。本文作者之前通过对人类全基因组进行全基因组关联分析（genome-wide association studies， GWAS）确定IRP2（也称为IREB2）是COPD的主要候选基因（4-6），此后作者证明IRP2蛋白在COPD患者的肺部含量增加（4）。已有的研究表明IRP2基因位于人类15q25染色体上，该染色体上还包括编码烟碱乙酰胆碱受体的几个部件的基因。此外 GWAS分析表明15q25还与肺癌，外周动脉疾病和尼古丁成瘾相关（7-10）。铁调节蛋白（The iron-regulatory proteins, IRPs）IRP1和IRP2尤其是IRP2负责调节哺乳动物体内细胞铁离子的平衡（11）。IRPs在十二指肠，脊髓和中枢神经扮演非常重要的生理角色，同时IRPs也可能是肺动脉高压和神经性病变等疾病发病原因（12-15）。在细胞内铁耗尽的情况下，IRPs通过与位于mRNA上铁体内平衡基因的铁反应元件（iron-response elements, IREs）结合，导致其翻译被抑制从而降低铁的储存并同时增加铁摄取（12,15）。但是IRP2在肺部的生理功能以及IRP2的mRNA转录还不是很清楚，同时IRP2在肺部暴露在香烟烟雾中COPD发病的响应机制也不是很明确。因此，作者试图通过将COPD实验中小鼠模型和人COPD数据整合，阐述由香烟烟雾引起的COPD中IRP2的功能。