文章简介
| 文章题目 | Single-cell RNA sequencing reveals a pro-invasive cancer-associated fibroblast subgroup associated with poor clinical outcomes in patients with gastric cancer |
| 中文题目 | 利用单细胞RNA测序揭示了胃癌患者中与不良预后关联的促侵袭的癌症相关成纤维细胞亚群 |
| 期刊名 | Theranostics IF: 11.556 |
| 作者 | Xuechun Li, Zhao Sun, Gongxin Peng, Yi Xiao, Junchao Guo, Bin Wu, Xiaoyi Li, Weixun Zhou, Jiarui Li, Zhe Li, Chunmei Bai, Lin Zhao, Qin Han, Robert Chunhua Zhao, Xiaoyue Wang |
| 发表时间 | 2022 |
| 实验材料 | 胃癌组织和癌旁组织 |
| 相关产品 | scRNA-seq |
研究背景
肿瘤微环境中的癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast，CAFs)能促进肿瘤进展，是潜在的癌症治疗靶点。目前，胃癌(gastric cancer, GC)组织中CAFs细胞亚群的异质性、功能和作用机制尚不清楚，阻碍了靶向CAFs的临床转化和应用。因此，有必要对GC中CAFs亚群的分类、功能、激活状态和空间分布进行全面探索和研究，为胃癌的靶向治疗提供指导。
研究方法
通过收集8例未经治疗的胃癌患者的癌组织和癌旁胃粘膜组织样本，进行单细胞RNA测序，通过对测序数据进行生物信息学分析，构建胃癌组织中CAF亚群等细胞亚群的基因表达图谱，揭示CAF亚群和其他肿瘤微环境细胞组分之间的互作网络变化。利用免疫荧光染色，验证CAF在不同胃癌病理亚型中的空间分布以及这些CAF亚群与促癌免疫细胞亚群互作关系。
主要结果
4.1 基于胃癌组织和癌旁组织的单细胞基因表达图谱鉴定了7个主要细胞亚群
为了明确胃癌组织中的细胞类型，通过8对胃癌组织和癌旁组织样本进行单细胞转录组测序，获得了来源于胃癌组织17,376细胞和来源于癌旁组织的19,521个细胞的基因表达数据（图1A），通过进行降维和无监督聚类，根据基因表达特征鉴定细胞亚群，共鉴定出23个细胞亚群，注释为上皮细胞、内皮细胞、纤维细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞和肥大细胞等7种主要的细胞类型，其中一些细胞类型具有多个细胞亚群，暗示胃癌组织中丰富的细胞异质性(图1B-C)。进一步分析发现，不同病人间不同细胞类群的组成比例存在差异，且癌组织和癌旁组织间不同细胞类群的组成比例也存在差异(图1D)。此外，通过每个细胞中细胞周期相关基因的表达水平，获得了每个细胞所处的细胞周期状态，发现来自肿瘤组织样品的大部分T细胞和小部分上皮细胞处于细胞周期G2、M或S期，其他细胞处于细胞周期的G1期(图1E)。
图1 胃癌组织和癌旁组织中单细胞基因表达图谱及细胞类型鉴定
4.2不同胃癌患者的肿瘤组织中上皮细胞具有异质性
鉴于胃癌组织和癌旁组织中上皮细胞的数量最多，进一步对11,187个上皮细胞进行分析，鉴定了16个上皮细胞亚群（图1A），其中8个亚群主要来源于癌组织（图1B），两个癌症干细胞亚群主要来源于1号患者和3号患者的肿瘤样本，说明肿瘤上皮细胞在患者之间具有高度异质性。此外，来自肿瘤样本的一部分上皮细胞表现出部分上皮-间充质转化(p-EMT)特征基因的表达水平增加(图2D-E)，其中肿瘤来源第10个细胞亚群中p-EMT相关基因的表达水平最高(图2F)，表明该细胞亚群是一个处于p-EMT活跃状态的细胞亚群，将其命名为EMT细胞亚群。
图2 胃癌组织中上皮细胞基因表达的异质性
4.3胃癌组织中部分内皮细胞表现出内皮–间质转化(EndMT)的基因表达特征
内皮细胞受到肿瘤微环境的严格调控，是肿瘤生长和转移的关键。我们进一步对2973个内皮细胞进行分析，鉴定了13个内皮细胞亚群，其中内皮细胞类群8被鉴定为淋巴内皮细胞，其余类群被鉴定为血管内皮细胞(图3A-B)；通过进行差异表达基因分析，发现相对癌旁组织，肿瘤来源的血管内皮细胞中细胞黏附和细胞外基质组织相关基因的表达上调(图3C)。值得注意的是，内皮细胞亚群4中，内皮细胞Marker基因（VWF）、成纤维细胞Marker基因(COL1A1、COL1A2)和肌动蛋白α 2 (ACTA2)高表达(图3D-F)。通过对来自不同队列胃癌患者的样本进行免疫荧光染色，在肿瘤样本中发现了同时表达VWF和α-SMA细胞类群(图3G)。通过对内皮细胞和成纤维细胞进行了拟时序分析，构建不同细胞类群间的潜在发育轨迹，内皮细胞亚群4处于内皮细胞和成纤维细胞发育轨迹的中间阶段(图3H-I)，表明内皮-间充质转化(EndMT)在肿瘤进展中发挥作用。
图3 胃癌组织和癌旁组织中内皮细胞亚群组成分析
4.4 细胞外基质CAFs促进侵袭，并与胃癌病人总生存期相关
鉴于癌症相关成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤进展中发挥多种作用，我们进一步分析了鉴定的成纤维细胞类群。基于特定细胞Maker基因的表达，鉴定了四个成纤维细胞亚群：肌成纤维细胞、周细胞、细胞外基质CAFs(eCAFs)和免疫调节CAFs(iCAFs)(图4A-B)。通过对四个成纤维细胞亚群中的差异表达基因进行分析，发现肌成纤维细胞高表达肌肉收缩、血管平滑肌细胞增殖和血管发育相关基因(图4C)，表明肌成纤维细胞在内皮细胞分化过程中的潜在功能；周细胞中血管发育相关基因上调表达，证实周细胞是包裹毛细血管并促进其存活的细胞；iCAFs高水平表达CXCL12、IL6和CXCL14等炎症相关Marker基因，而且肿瘤来源iCAFs高表达IL6ST、NFKBIA、NT5E、SERPINF1和NFKBIZ等炎症反应调控相关基因(图4C)，表明它们与免疫细胞沟通中发挥作用。此外，我们发现了一个未知的CAF亚群，高表达ECM相关基因(图4C)，将其定义为细胞外基质CAFs(eCAFs)，其中肿瘤来源的eCAFs高表达肿瘤侵袭相关基因(MMP14、LOXL2和POSTN)(图4D)；基于TCGA中的胃癌转录组数据，进行基因表达水平与预后之间的相关性分析，发现POSTN基因表达水平高的患者，总生存期仍较短(图4E)；这些结果表明eCAFs是促进肿瘤转移的肿瘤微环境的重要组成部分。
通过免疫组化染色分析了胃癌病理切片中的CAF的Marker基因表达，分析四个CAF亚群在胃癌组织中的分布，发现iCAF在肿瘤腺体中富集，分布在肿瘤细胞周围(图4F)，在淋巴样结节样结构中发现了iCAF(图4F)，表明它们可能参与了淋巴细胞的调节；值得注意的是，肿瘤腺体区iCAF分布数量多于远端间质区(图4G)。POSTN阳性区域按肿瘤腺体、侵袭前、远端间质排列增加(图4H-I)，说明eCAFs主要存在于远端间质区域，eCAFs的不同空间分布表明它们在肿瘤微环境中的作用不同。
图4 胃癌组织和癌旁组织中成纤维细胞亚群组成及功能分析
4.5胃癌组织中的肿瘤微环境处于免疫抑制状态
T细胞是肿瘤微环境中高度富集的免疫细胞。通过进一步分析肿瘤组织和癌旁组织中的6874个T细胞，鉴定了14个T细胞亚群(图5A)。根据基因表达特征，我们确定了12个亚群，包括8个CD8+T细胞亚群和4个CD4+T细胞簇(图5A-B)。通过已知的Marker基因表达，进一步将这些T细胞亚群：CD8+效应记忆T细胞、CD8+效应T细胞、CD4+中央记忆前体T细胞、CD8+中央记忆T细胞、Th17细胞、调节性T细胞、耗尽性T细胞和增殖性T细胞(图5A)。CD8-C3-PDCD1和CD4-C4-CXCL13为耗尽性T细胞亚群，CD8-C3-PDCD1亚群中，PDCD1和HAVCR2基因显著上调表达，而CD4-C4-CXCL13亚群中，PDCD1、TIGIT和CTLA4基因显著上调表达(图5B)。值得注意的是，CD8-C3-PDCD1亚群高水平表达CD69和各种细胞毒基因，如GZMH、GZML、NKG7，表明其可能被激活(图5B)。通过免疫组化染色分析了胃癌病理切片中的CD8和PD1基因表达，证实了胃癌组织中存在耗尽性T细胞，T细胞在GC淋巴组织中同时表达CD8和PD1(图5C-D)。这些结果表明，胃癌组织处于免疫抑制状态。
图5 胃癌组织和癌旁组织中T细胞亚群组成及功能分析
4.6 胃癌组织肿瘤微环境中细胞间通信分析
基于单细胞数据，使用CellPhoneDB工具包进行了细胞-细胞通信分析，CellPhoneDB根据配体-受体相互作用和不同细胞类型配体和受体的表达，推断细胞-细胞通信网络。肿瘤微环境中不同基质细胞和免疫细胞间存在丰富细胞-细胞通信信号(图6A-B)，iCAF和eCAFs通过与趋化因子、炎症细胞因子反应和免疫调节相关的受体-配体相互作用与CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg和巨噬细胞进行通信(图6C)。
通过免疫组化分析显示，淋巴样结节状结构中CAFs的主要亚群是iCAFs(图6D)，它们位于CD8阳性和PD1阳性T细胞周围，表明iCAFs参与调节T细胞的招募。通过免疫组化比较了骨膜蛋白和CD163表达部位，验证eCAFs和M2巨噬细胞间的潜在互作关系，结果发现骨膜素阳性eCAFs与CD163阳性M2巨噬细胞空间上相关(图6E)，存在潜在的互作关系。通过从胃癌组织中分离获得CAFs细胞，进行体外传代培养，细胞传代四次后，几乎所有的CAFs都表达骨膜蛋白(图6F)。我们使用第五代CAFs作为eCAFs，以间充质干细胞(MSCs)作为阴性对照，进行Transwell迁移实验，以确定eCAFs是否招募了M2巨噬细胞。我们发现，与MSCs相比，eCAFs组M2巨噬细胞发生迁移数量增加(图6G)，且骨膜蛋白在eCAFs中的表达显著高于MSCs(图6H)。通过在MSCs中过表达骨膜蛋白，发现过表达MSCs增加了M2巨噬细胞的迁移(图6I-J)骨膜蛋白在招募M2巨噬细胞中的作用(图6I)。基于这些结果，eCAFs在体外表现出增强的趋化性，吸引M2巨噬细胞。综上所述，iCAFs和eCAFs在肿瘤微环境中的免疫细胞招募中具有不同的功能。
图6 胃癌组织肿瘤微环境中细胞间通信及功能分析
4.7 浸润弥漫性胃癌肿瘤微环境促进癌症进展
我们比较了弥漫型和肠型胃癌患者的细胞亚群组成差异，以研究细胞异质性与胃癌病理分类的相关性。在3例弥漫性胃癌患者中，有2例患者的EMT上皮细胞的含量高于3例肠道型胃癌患者(图7A)，证实弥漫性胃癌中未分化细胞的数量较多。相对于肠型胃癌患者，弥漫性胃癌标本中基质细胞(内皮细胞、CAF和免疫细胞)的比例也较高 (图7B)。在弥漫性肿瘤样本中，免疫细胞的比例高于肠道型肿瘤样本(图7C)，说明弥漫性肿瘤样本的免疫细胞浸润程度较高。
在免疫细胞的亚型中，我们发现在弥漫性肿瘤中表达CXCL13的T细胞相对丰度更高(图7D)，这表明弥漫性GC具有更强的抑制免疫微环境。我们还比较了肠型和弥漫性肿瘤的病理特征，肠型肿瘤与间质区界限明显，而弥漫性肿瘤与间质区界限不明显。E-cadherin在弥漫性肿瘤中的表达水平低于肠型肿瘤，表明EMT上皮细胞在弥漫性肿瘤中的比例较高(图7E)。在肠道型肿瘤中，淋巴样结节样结构沿肿瘤区域边缘发育(图7F)。我们发现弥漫性肿瘤的淋巴样结节样结构位于肿瘤细胞附近，且弥漫性肿瘤的淋巴样结构数量高于肠道肿瘤(图7F)。PD1仅在淋巴结构中表达(图7F)，表明弥漫性肿瘤中浸润的T细胞更多。
这些结果显示，弥漫性胃癌具有“四高”表型(高EMT、高间质细胞、高免疫细胞浸润、高T细胞衰竭)，表明弥漫性GC患者的预后较差可能是由于转移性肿瘤细胞较多以及免疫抑制微环境所致。
图7 不同胃癌病理亚型间细胞亚群组成差异
总结及讨论
通过8名胃癌患者的癌组织和癌旁粘膜组织进行单细胞转录组测序，解析了胃癌肿瘤微环境中CAFs的分类、功能、起源及与其他细胞亚群的相互作用，并进一步验证CAFs在不同病理类型中的空间分布。这些结果揭示了CAFs在调节肿瘤微环境中的独特作用，参与免疫调节、侵袭、迁移和血管生成等过程。值得注意的是，胃癌中eCAF趋化能力增强，促进了M2巨噬细胞的招募，并与胃癌患者预后不良有关，表明抑制eCAF激活可能是胃癌患者潜在的治疗靶点。
参考文献
Li, X., Sun, Z., Peng, G., Xiao, Y., Guo, J., Wu, B. et al. (2022). Single-cell RNA sequencing reveals a pro-invasive cancer-associated fibroblast subgroup associated with poor clinical outcomes in patients with gastric cancer. Theranostics, 12, 620-638.
