技术背景
单细胞RNA测序(scRNA-seq)可以为癌症细胞的细胞异质性和肿瘤微环境（TME）中不同亚群的特征提供有价值的信息，因为它允许一次大规模地确定数千个细胞的转录组图谱。
研究目标
胆囊癌(GC)是一种恶性程度高、侵袭性强的恶性肿瘤，发病率低但死亡率高，5年生存率不到5%，严重危害人类健康。由于早期无症状、起病隐匿、进展迅速，绝大部分胆囊癌患者在确诊时已不适合手术治疗。尽管化疗、靶向治疗和免疫疗法为患者提供了治疗选择，但仅有少数患者反应良好。癌细胞异质性、肿瘤微环境细胞构成、不同细胞类型之间的相互作用等因素都会影响胆囊癌的治疗效果，因此，以上科学问题的解决可以为胆囊癌提供新的治疗策略，提高目前方案疗效，为临床治疗带来新的突破。
研究方法
选取原位胆囊癌、淋巴结转移肿瘤组织及癌旁正常组织进行单细胞转录组测序，对胆囊癌肿瘤细胞及其微环境细胞的基本特征进行了分析研究。运用t-SNE（细胞亚型识别）、单细胞转录轨迹分析-2（Monocle 2）、CellPhoneDB（细胞受体配体互作分析工具）等方法，结合基因集合富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）、GO分析、KEGG分析等基因分析方法，详细研究单细胞RNA测序结果。在本研究中，首次利用scRNA-seq对原发性、淋巴结转移性肿瘤组织以及相邻的正常胆管组织进行了瘤内异质性和TME特征细胞的解析。本研究将进一步深入了解胆囊癌细胞的肿瘤异质性，确定胆囊癌患者TME的细胞特征。
研究成果
该研究利用单细胞测序技术全面解析了胆囊癌图谱，分别从癌细胞异质性、肿瘤微环境细胞浸润、活性以及相互作用等多个方面全面表征了胆囊癌组织的疾病特征，为胆囊癌中免疫微环境功能解析及其新治疗方案的研究提供了新的视角。主要结果如下：
- 获得24,887个单细胞的转录组图，特征为10个细胞群，包括上皮细胞、神经内分泌肿瘤细胞、NKT细胞、B细胞、RGS5+成纤维细胞、POSTN+成纤维细胞、PDGFRA+成纤维细胞、内皮细胞、髓系细胞和肥大细胞；
- 胆囊癌肿瘤细胞具有高度异质性，腺鳞癌肿瘤中的腺癌具有向鳞癌分化的潜能；
- 胆囊内分泌肿瘤起源与胆囊癌腺癌和鳞癌显著不同，其肿瘤微环境中很少存在淋巴细胞和髓系细胞浸润，并在多个样本中得到证实；
- 腺癌和鳞状细胞癌中有大量免疫细胞浸润，神经内分泌肿瘤中未见免疫细胞浸润，间质细胞明显富集；
- 胆囊癌微环境中巨噬细胞存在从CCL20hi / CD163lo 状态向CCL20lo / CD163hi 抗炎状态的动态变化过程，且中性粒细胞在肿瘤组织中比例显著下降；
- 胆囊腺癌微环境中存在T细胞的浸润杀伤功能，但T细胞往往大量表达TIGIT、CTLA4等耗竭性分子，这可能是其对免疫耐受的主要原因；
- 两种不同的内皮细胞(KDR+和ACKR1+)参与血管生成和淋巴管生成；
- 胆囊癌细胞、内皮细胞和巨噬细胞之间存在明显的配体-受体介导的相互作用关系。以上发现提示靶向肿瘤免疫微环境和血管生成可能是胆囊癌上皮细胞癌的有效治疗手段，并从细胞和分子角度都提供了新的潜在靶点。
重点讨论研究结果
第一方面：阐述胆囊腺癌、腺鳞癌和NET的特点及其差异。
- 腺癌细胞失去抗原呈递MHC II分子，可转分化为鳞状肿瘤细胞。
- 上皮性GC中的免疫抑制TME由浸润的CD4+ T-reg细胞、CXCL13+ Th细胞、CCL20lo/CD163hi细胞和APOE+巨噬细胞组成；然而，它是胆囊NET的免疫沙漠表型。
- 重塑胆囊癌组织中的间质和内皮细胞，促进血管生成和淋巴管生成，维持胆囊癌的生长和转移。这些结果解决了胆囊癌组织的单细胞转录组分析，提高了我们目前对胆囊癌发展和进展的理解，并为未来胆囊癌提供了新的治疗靶点。
小结：胆囊腺癌和腺鳞癌起源于胆囊上皮细胞，而胆囊NETs则来源于神经内分泌细胞或肽能性神经嵴Kulchitsky细胞，聚集了三个不同的EPCAM+上皮肿瘤细胞亚群，包括腺癌衍生的腺细胞、鳞状细胞癌和神经内分泌癌细胞。每个亚群都富含不同的生物学过程或信号通路，表现为正常胆囊上皮功能的丧失，以及在生长、代谢或疾病方面的其他特性的获得，尤其是鳞状细胞癌和NET细胞亚群。肿瘤细胞的瘤内异质性和多样性特性使其难以通过单靶点药物或治疗手段对胆囊癌发挥广泛而有效的治疗作用。
第二方面：应用到临床治疗—免疫疗法
胆囊癌微环境的单细胞分析支持免疫疗法。
首先讨论免疫细胞中淋巴细胞
胆囊腺癌中有丰富多样的淋巴细胞，包括NK细胞和多种亚型的T细胞，提示为高度免疫浸润的“热肿瘤”表型，通常提示免疫治疗的良好反应。
- 对于CD8+ T细胞，尽管细胞毒性分子(GZMA、GZMB、NKG7和PRF1)高表达，但部分CD8+ T细胞的耗竭性分子(CTLA4、PDCD- 1和TIGIT)呈阳性，表明它们的肿瘤细胞毒性活性受到抑制。
- 在CD4+ T细胞中，naïve CD4+ T细胞、CXCL13+/CD4+ Th细胞和CD4+ T-reg细胞均具有抗免疫活性，提示存在免疫耐受环境。值得注意的是，免疫检查点蛋白CTLA-4和TIGIT在T-reg细胞中高表达，提示CTLA-4和TIGIT阻断可能对GC的治疗有效。
然后分析免疫细胞中髓系细胞，重点是巨噬细胞—促炎状态到抗炎状态转变
胆囊腺癌组织TME中可见与淋巴细胞相似的多个髓系细胞亚簇，以抗炎巨噬细胞为主导细胞群。
- 发现巨噬细胞在GC组织中从促炎状态向抗炎状态的一系列转变。此外，抗炎而非促炎的巨噬细胞与GC中其他细胞的相互作用增加，提示巨噬细胞在免疫抑制微环境形成中发挥关键作用，这可能是GC治疗中潜在的治疗靶点。
最后基质细胞—血管生成和淋巴管生成
血管生成和淋巴管生成是胆囊癌发生和发展的关键。
- 在研究中，我们发现与相邻正常组织相比，参与血管相关过程的RGS5+成纤维细胞在GC组织中显著增加。
- 结合内皮细胞富集KDR+ ECs的发现，这些结果反映了血管生成增强可能是GC进展过程中组织重塑的主要事件。
- 另一个富集的上皮簇是ACKR1+ ECs，它参与了白细胞的细胞黏附、白细胞与血管内皮细胞的黏附以及白细胞迁移，因此可能反映了肿瘤组织中的淋巴管生成。
这些结果与我们发现的高免疫浸润相一致。
关于基质细胞的研究找到仍需探讨的点：
除了介导淋巴细胞的浸润外，这些基质细胞与淋巴细胞/髓系细胞之间的相互作用也可能调节肿瘤浸润细胞的炎症状态，值得进一步探讨。
此外，ECs可作为半专业的抗原提呈细胞，触发T细胞共刺激和特异性免疫细胞激活。在胆囊组织中，只有ACKR1+ ECs（而不是KDR+ ECs）显示了MHCII分子的阳性表达，以及Th1, Th2, 和 Th17的细胞高度分化活性，表明这些 ECs可能涉及免疫监视，介导T细胞分化。
第三方面：补充研究中临床上少见的一种胆囊癌类型：讨论胆囊NET
胆囊NET的临床表现、治疗及预后报道较少。通过单细胞转录组分析，我们鉴定了胆囊NET细胞的新生物标志物，并发现了胆囊NET与胆囊腺癌的多重差异。
- 胆囊NET细胞的CNV评分在原发性和淋巴转移性肿瘤中均未升高，表明至少在复制水平上存在少量遗传变异。
- 胆囊NET细胞与其他胆囊肿瘤呈明显的簇状，这与肿瘤起源不同是一致的。
- 与腺癌不同的是，胆囊NET肿瘤具有罕见的免疫细胞。寒冷的肿瘤微环境或免疫沙漠微环境以及微小的遗传变异提示胆囊NET可能对免疫治疗反应不佳，肿瘤细胞靶向治疗可能是一种有效的治疗策略。
