文章简介

文章题目	The m6A Reader IGF2BP2 Regulates Macrophage Phenotypic Activation and Inflammatory Diseases by Stabilizing TSC1 and PPARγ
中文题目	M6A识别蛋白IGF2BP2通过结合并稳定TSC1和PPARγ的RNA调控巨噬细胞表型激活影响炎症疾病的发展
期刊名	Advanced Science IF: 16.806
作者	Wang, Xia；Ji, Yuge；Feng, Panpan；Liu, Rucheng；Li, Guosheng；Zheng, Junjie；Xue, Yaqiang；Wei, Yaxun；Ji, Chunyan；Chen, Dawei
发表时间	2021
实验材料	巨噬细胞等
测序平台	Illumina NovaSeq 6000
相关产品	iRIP-seq

 

研究背景

在炎症情况下，巨噬细胞可激活为促炎的M1型和抗炎的M2型，通过调控炎症启动和炎症消退的动态平衡，进而调控组织稳态，影响疾病的发展。目前，已经明确了组织微环境中的干扰素和白介素等系列胞外信号协同调控巨噬细胞表型激活和转换。然而，目前对巨噬细胞表型激活的细胞内调控因子及其机制的认识仍然不清晰。

mTOR信号通路通过整合细胞内和细胞外信号，参与决定免疫细胞命运。TSC1可抑制mTORC1的活性，促进M1型并抑制M2型巨噬细胞激活。mTORC1激活可通过PPARγ增加脂肪酸和胆固醇合成，促进抗炎的M2型巨噬细胞的代谢重编程。然而，目前仍然不清楚细胞内mTORC1信号通路分子表达的转录后调控机制。

m6A是真核生物mRNA上最普遍的修饰，影响mRNA的剪接、稳定性、转运和翻译等过程，进而影响基因表达。IGF2BP2作为m6A的“阅读蛋白”，它可识别并结合mRNA上的m6A修饰位点，促进目标基因mRNA的稳定性，进而调控基因表达。目前，已经明确了IGF2BP2在糖尿病和癌症中的功能和机制。然而，目前对IGF2BP2在免疫调控中的功能和机制知之甚少。

为了回答上述科学问题，我们合作的客户在Advanced Science杂志（中科院JCR期刊1区，五年IF=15.627）在线发表题为“The m6A Reader IGF2BP2 Regulates Macrophage Phenotypic Activation and Inflammatory Diseases by Stabilizing TSC1 and PPARγ”的研究论文(Wang et al. 2021)。该研究揭示了IGF2BP2在调控巨噬细胞激活中的关键作用及潜在机制，研究结果表明IGF2BP2是炎症性疾病中潜在的巨噬细胞相关的治疗靶点。我们作为课题的参与者完成了研究中的iRIP-seq实验内容和个性化数据分析工作。

研究方法

首先，通过构建IGF2BP2敲除的巨噬细胞，探索炎症诱导下，IGF2BP2敲除对M1和M2型巨噬细胞激活的影响；

其次，通过iRIP-seq等实验明确了IGF2BP2在巨噬细胞表型激活中的作用机制；

最后，通过建立结肠炎和哮喘小鼠模型，利用小鼠的骨髓细胞交叉移植等实验，验证了IGF2BP2在炎症疾病中的功能。

主要结果

1. IGF2BP2缺失增强LPS诱导下M1型巨噬细胞激活

为了明确IGF2BP2在M1型巨噬细胞激活中的功能，使用LPS诱导骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs），发现IGF2BP2的mRNA和蛋白水平的表达量均升高（图1a和b）。通过构建IGF2BP2双敲除的小鼠，分离获得IGF2BP2^−/−的BMDMs，进行LPS诱导，发现相对于野生型BMDMs，IGF2BP2^−/−的BMDMs中IL1𝛽、IFN-𝛾、IL12、IL6、TNF-𝛼等细胞因子在mRNA水平的表达量显著升高（图1c）。此外，相对于野生型BMDMs，LPS诱导的IGF2BP2^−/−的BMDMs中MEK1/2和ERK信号增强，而p-AKT信号减弱（图1b）。这些结果表明，IGF2BP2缺失增强LPS诱导下M1型巨噬细胞激活。

图1 IGF2BP2敲除增强了骨髓来源巨噬细胞对LPS诱导的敏感性

2. STAT6结合HMGA2介导IL4诱导IGF2BP2表达影响M2巨噬细胞激活

为了明确IGF2BP2在M2型巨噬细胞激活中的功能，使用IL4诱导BMDMs，发现IGF2BP2的mRNA和蛋白水平的表达量均升高（图2a和b），而在IL4诱导的同时，使用JAK抑制剂（AG-490和JANEX-1）、PI3K抑制剂（Wortmannin）、STAT6抑制剂（AS1517499）处理，可抑制IL4诱导引起的IGF2BP2的表达水平上调（图2c和d），但是mTOR抑制剂（PP242）和mTORC1抑制剂（Rapamycin）没有抑制效果（图2e），表明IL4通过JAK-STAT6通路诱导BMDMs中IGF2BP2的表达。前人研究发现，HMGA2可参与调控IGF2BP2的转录，IL4处理也可增加BMDMs细胞中HMGA2的表达（图2f）。通过在BMDMs细胞进行STAT6的染色质免疫沉淀实验（ChIP），利用ChIP-qPCR证实STAT6的确可以结合在HMGA2的启动子区，调控HMGA2的表达，进一步调控IGF2BP2的表达（图2g）。相对于野生型BMDMs，进行IL4诱导后，IGF2BP2^−/−的BMDMs中Arg1、CD206、Ym1、Fizz1、TGF-𝛽等细胞因子在mRNA水平的表达量显著降低（图2h）。这些结果表明，STAT6结合HMGA2，促进IGF2BP2表达，进而参与IL4诱导M2型巨噬细胞激活。

图2 IL4通过JAK-STAT6途径调控IGF2BP2表达影响M2型巨噬细胞激活

3. 巨噬细胞中IGF2BP2通过识别m6A位点结合并稳定PPAR𝜸的mRNA

为了探索IGF2BP2调控巨噬细胞激活的分子机制，利用改进的RNA结合蛋白免疫共沉淀及高通量测序技术（iRIP-seq），发现巨噬细胞中IGF2BP2可结合Kcnn4、Arg1、Hist1h1b、Hist1h4c、Cd74、Ak2、H2-Eb1、Csf1r、PPAR𝛾等多个在巨噬细胞激活及极化过程中发挥重要功能基因的mRNA。相对于野生型BMDMs，进行IL4诱导后，IGF2BP2^−/−的BMDMs中PPAR𝛾表达显著降低（图3a），而且PPAR𝛾下游的Lpl、Cd36、Fabp4、Lipe、Fasn、Acaca、Acox1、Cpt1a、Acadm、Acadl、Adipoq等脂肪酸代谢基因的表达量也显著降低（图3b）。iRIP-seq数据分析表明，IGF2BP2在PPAR𝛾的mRNA上有特定的结合位点（图3c），MeRIP-qPCR显示PPAR𝛾的mRNA上具有丰富的m6A修饰（图3d）。基于IGF2BP2在PPAR𝛾的结合位点，合成包含m6A修饰和未修饰的PPAR𝛾单链RNA序列，进行RNA pull-down，发现IGF2BP2只能结合具有m6A修饰PPAR𝛾单链RNA（图3e）。进一步实验发现，敲低m6A修饰酶Mettl14后，野生型BMDMs中PPAR𝛾的表达降低，而IGF2BP2^−/−的BMDMs中PPAR𝛾的表达不受影响（图3f和g），且野生型BMDMs中IGF2BP2结合PPAR𝛾的mRNA能力也降低（图3h）。鉴于IGF2BP2可通过识别m6A结合并稳定mRNA，我们进行了RNA降解实验，结果显示，进行转录抑制处理后，相对于野生型BMDMs，IGF2BP2^−/−的BMDMs中PPAR𝛾的mRNA的降解速率显著加快（图3i和j）。这些结果表明，STAT6-IGF2BP2-PPAR𝛾调控轴，至少部分参与调控M2型巨噬细胞激活过程。

图3 IGF2BP2通过m6A依赖的方式增强PPAR𝛾 mRNA稳定性

4. IGF2BP2通过识别m6A结合并调控TSC1同时介导M1型和M2型巨噬细胞激活

为了进一步明确IGF2BP2是否通过mTORC1调控巨噬细胞的激活，我们进一步探究了IGF2BP2的作用机制。结果发现，相对于野生型BMDMs，进行IL4诱导后，IGF2BP2^−/−的BMDMs中mTORC1激活，导致下游S6K1和4E-BP1的蛋白磷酸化水平升高（图4a），而mTORC1的负调控因子TSC1的表达水平降低（图4a）。实际上，在野生型BMDMs中，随着IL4的诱导，IGF2BP2和TSC1的mRNA水平的表达量均逐渐升高（图4b）。进一步研究发现，相对于野生型BMDMs，进行IL4诱导后，IGF2BP2^−/−的BMDMs中mTOR依赖降低，且在M2型巨噬细胞激活中具有重要功能的C/EBP𝛽的表达量也降低（图4c），而同时使用mTORC1抑制剂rapamycin可部分恢复IGF2BP2^−/−的BMDMs中Fizz1、TGF-𝛽、Ym1、CD206等M2型巨噬细胞激活相关基因的表达（图4d）。

鉴于TSC1也可调控M1型巨噬细胞激活，本研究进一步探索IGF2BP2影响M1巨噬细胞激活的潜在机制。研究发现，随着LPS的诱导，在野生型BMDMs中，IGF2BP2和TSC1的mRNA水平的表达量均逐渐升高（图4e），而在IGF2BP2^−/−的BMDMs中，TSC1蛋白水平降低导致mTORC1激活，mTORC1下游的S6K1和4E-BP1的蛋白磷酸化水平升高（图4f）。TSC1可以结合并稳定TSC2，TSC1和TSC2形成复合物抑制MEK/ERK活性进而抑制M1巨噬细胞激活。我们进一步实验发现，LPS的诱导后，IGF2BP2^−/−的BMDMs中，TSC1和TSC2的mRNA水平的表达量均降低（图4g），IL1β、IFN-γ、TNF-α等M1巨噬细胞激活相关基因的表达上调，而使用MEK1/2抑制剂PD98059可降低IL1β、IFN-γ、TNF-α等M1巨噬细胞激活相关基因的表达（图4h），但是使用mTORC1抑制剂rapamycin并没有类似的效果（图4i）。

iRIP-seq数据分析表明，IGF2BP2在TSC1的mRNA上也有特定的结合位点（图4j）。MeRIP-qPCR显示TSC1的mRNA上具有丰富的m6A修饰（图4k）。基于IGF2BP2在TSC1的结合位点，合成包含m6A修饰和未修饰的TSC1单链RNA序列，进行RNA pull-down，发现IGF2BP2只能结合具有m6A修饰TSC1单链RNA（图4l）。进一步实验发现，敲低m6A修饰酶Mettl14后，野生型BMDMs中TSC1的表达降低，而IGF2BP2^−/−的BMDMs中TSC1的表达不受影响（图4m），且野生型BMDMs中IGF2BP2结合TSC1的mRNA能力也降低（图4n）。鉴于IGF2BP2可通过识别m6A结合并稳定mRNA，进行了RNA降解实验，结果显示，进行转录抑制处理后，相对于野生型BMDMs，IGF2BP2^−/−的BMDMs中TSC1的mRNA的降解速度显著加快（图4o和p）。这些结果表明，IGF2BP2通过识别TSC1的m6A修饰结合并稳定TSC1的mRNA调控其表达，分别通过TSC1/mTORC1和TSC1/2/MEK/ERK途径调控M2型和M1型巨噬细胞激活。

图4 IGF2BP2识别TSC1的m6A修饰并通过依赖或独立于mTORC1的方式调控巨噬细胞激活

5. 造血细胞中IGF2BP2的表达参与调控结肠炎症的发展

本研究进一步探索了IGF2BP2在炎症疾病中的功能，结果发现，来源于溃疡性结肠炎患者的CD68+巨噬细胞，大约一半细胞均表达IGF2BP2（图5a）。在右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导小鼠结肠炎模型中，与WT小鼠相比，IGF2BP2^−/−小鼠结肠炎更严重，伴随更快的体重下降速度、更高的疾病活动指数(DAI)(图5b)和更小的结肠长度(图5c)，更高水平的炎症细胞浸润和腺窝破坏程度(图5d)，回肠黏膜固有层(LP)中IL10表达降低而M1巨噬细胞激活标志物IL1𝛽、IFN-𝛾、IL12、IL6、IL17的表达水平上升(图5e)。

为了明确造血细胞和非造血细胞中IGF2BP2的缺失对结肠炎的影响，通过将WT或IGF2BP2^−/−小鼠的骨髓细胞交叉移植到WT或IGF2BP2^−/−小鼠上（WT→WT,WT→IGF2BP2^–/–,IGF2BP2^–/–→WT,IGF2BP2^–/–→IGF2BP2^–/–），获得了骨髓嵌合小鼠(图5f)，移植7周后，DSS诱导结肠炎。结果显示，造血细胞中IGF2BP2敲除的小鼠(IGF2BP2^–/–→WT,IGF2BP2^–/–→IGF2BP2^–/–)比造血细胞中IGF2BP2表达的小鼠(WT→WT,WT→IGF2BP2^–/–)有更严重的疾病表型，包括体重大幅下降(图5g)，DAI增加(图5g)，结肠长度缩短(图5h)，严重的结肠损伤(图5i)，显著的组织学炎症细胞浸润(图5i)和更高水平促炎细胞因子(图5j)。有趣的是，相对于接受野生型骨髓细胞的WT小鼠(WT→WT)，接受野生型骨髓细胞的IGF2BP2敲除小鼠(WT→IGF2BP2^–/–)中，促炎细胞因子水平更高(图5g-j)，这表明敲除IGF2BP2也影响其他细胞中炎症细胞因子的释放。这些结果表明，IGF2BP2缺失的巨噬细胞加重了DSS诱导的小鼠结肠炎。

图5 IGF2BP2−/−免疫细胞使小鼠易患结肠炎

6. IGF2BP2敲低的造血细胞缓解蟑螂变应原引起的肺部炎症

我们已经证明，IGF2BP2高表达倾向于促进M2巨噬细胞激活。进一步研究发现，IGF2BP2在哮喘患者中也有表达，且在人哮喘组织标本中主要与巨噬细胞共定位(图6a)。为了进一步明确IGF2BP2是否影响体内M2型巨噬细胞激活，建立了蟑螂变应原(CRE)诱导的变应性肺炎的骨髓嵌合小鼠模型(图6b)。与IGF2BP2缺陷嵌合小鼠(IGF2BP2^–/–→IGF2BP2^–/–)相比，野生型(WT→WT)嵌合小鼠有更严重的哮喘。在造血细胞IGF2BP2缺乏的情况下，CRE处理后，接受WT骨髓细胞的IGF2BP2敲除小鼠(WT→IGF2BP2^–/–)表现出与野生型小鼠(WT→WT)同样严重的哮喘症状。相反，造血细胞缺乏IGF2BP2的小鼠(IGF2BP2^–/–→WT)表现出与野生型小鼠(WT→WT)相似的哮喘病理，伴随明显的炎症细胞肺部募集及密集的支气管旁浸润(图6c)，且支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎症细胞总数(图6d)以及巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞均增加(图6e)。随后，我们检测了M2巨噬细胞激活相关基因的表达水平，结果显示，IGF2BP2^–/–→WT小鼠肺组织中，ARG1、CD206、Ym1、Fizz1和IL10的水平远低于WT→WT小鼠(图6f)。此外，CRE处理后，与WT→WT小鼠相比，IGF2BP2^–/–→WT小鼠肺组织中M2巨噬细胞水平下降(图6g和h)。这些结果表明，造血细胞中的IGF2BP2可能在CRE诱导的过敏性炎症中促进M2巨噬细胞激活，从而加剧肺部炎症的发展。

图6 IGF2BP2缺陷骨髓细胞能够缓解CRE诱导的哮喘

总结及讨论

本研究表明，RNA的m6A修饰在调控巨噬细胞极化激活过程中具有重要功能。IGF2BP2的缺失促进M1巨噬细胞激活，导致更严重的DSS诱导的实验性结肠炎，但IGF2BP2通过稳定TSC1和PPARγ的mRNA而抑制M1巨噬细胞激活。总之，本研究发现IGF2BP2是巨噬细胞极化激活中的新调控因子(图7)，可能有助于进一步了解m6A修饰在包括炎症、过敏和肿瘤进展等多个巨噬细胞定向位点中的病理生理功能。

图7 IGF2BP2调控巨噬细胞激活的信号通路

参考文献：

1.Wang, X., Ji, Y., Feng, P., Liu, R., Li, G., Zheng, J. et al. (2021). The m6A Reader IGF2BP2 Regulates Macrophage Phenotypic Activation and Inflammatory Diseases by Stabilizing TSC1 and PPARγ. Advanced Science, 2100209.