1.研究简介
| 文章题目 | MACF1 promotes osteoblast differentiation by sequestering repressors in cytoplasm |
| 中文题目 | MACF1通过在细胞质中隔离抑制促进成骨细胞的作用 |
| 期刊名 | Cell Death & Differentiation IF：15.828 |
| 作者 | Lifang Hu， Chong Yin ， Dong Chen ， Zixiang Wu， Shujing Liang ，Yu Zhang，Zizhan Huang， Shuyu Liu， Xia Xu ， Zhihao Chen ，Yi Zhang ，Airong Qian |
| 发表时间 | 2021年 |
| 实验材料 | 老鼠成骨细胞系MC3T3-E1 |
| 闯平台 | Illumina NextSeq 500 |
| 相关产品 | RNA-seq , ChIP-seq |
2.研究背景
成骨细胞的分化是一个受时空遗传程序调控的动态过程。在此过程中细胞骨架蛋白除了参与细胞骨架的改变，同时也调控多种信号通路，包括Wnt、Hedgehog、MAPK等。
微管微丝交联因子MACF1是一种多结构域的细胞骨架蛋白，广泛参与细胞骨架组装、细胞迁移、增殖和分化等生理过程。
我们的合作客户在《Cell Death & Differentiation》上发表论文“MACF1 promotes osteoblast differentiation by sequestering repressors in cytoplasm”[1]，该研究首次发现细胞骨架蛋白MACF1通过影响成骨分化相关的转录因子在细胞中的定位，影响成骨细胞的分化。我们提供转录组测序技术、CO-IP联合蛋白质谱技术及ChIP-seq技术帮助老师最终锁定了MACF1的互作蛋白及其调控机制，让我们详细了解一下本研究的主要结果吧……
3.研究结果
1.MACF1能调控成骨分化，骨矿化及Wnt信号通路相关基因的转录
课题组首先通过碱性磷酸酶ALP活性检测及成骨分化标志物基因ALP、Runx2、Osterix的检测，证实在人成骨样细胞SaOS-2中敲低MACF1会抑制成骨分化（图1A-C）。
图1
为了进一步研究MACF1调控成骨分化的机制，作者对敲低MACF1后诱导成骨分化的不同时间点的细胞进行了转录组检测，分别选取了0天、3天、5天、10天共4个时间点，相比较对照细胞，敲低MACF1后共引起7大类（7321个基因）基因的差异表达，其中第一类基因在分化早期（3天）、分化中期（5天）升高，而在分化后期（10天）呈现出下调的趋势，此外第7类基因在敲低MACF1的细胞中呈显著下调趋势，这两类基因显著富集在成骨分化相关的DNA复制及细胞周期相关通路，进一步对敲低MACF1后下调的基因进行GO通路富集分析，结果显示这类基因富集在成骨分化、骨化及胶原组织通路中（图1 D-E）。
图1
以上结果表明，MACF1敲除后的确会抑制成骨分化，不管是从细胞表型变化还是从细胞内整体基因转录变化模式看，这种趋势均是一致的。但细胞骨架蛋白MACF1引起基因表达模式改变的机制还需要进一步的研究。
2. 敲低MACF1会下调转录因子TCF7和LEF1的表达
为了进一步明确MACF1影响成骨分化的机制，进一步分析了上述转录组数据中差异表达的转录因子，尤其是其中调控Wnt信号相关的转录因子，结果显示TCF7和LEF1在敲低MACF1后均下调（图2A-B）。
图2
图2
以上结果说明MACF1会影响成骨分化相关转录因子TCF7和LEF1的表达，但究竟是通过何种方式影响基因的表达，还需要进一步的实验。
3. MACF1的互作蛋白CDK12及MEAF6是细胞成骨分化的抑制因子
为了进一步研究MACF1的作用，课题组利用了免疫共沉淀结合蛋白质谱分析（CoIP-MS）检测了敲低MACF1前后，MACF1互作的蛋白。结果显示有5个蛋白在敲低组和对照组细胞中均出现，说明这5个蛋白（ACTB、CDK12、HIST1H4A、MEAF6、VIM）和MACF1存在互作。对敲低组和对照组的互作蛋白进行富集性分析，结果显示对照组互作的蛋白主要富集在filament及细胞外基质通路，而敲低MACF1后基因主要富集在nucleus通路（图3 A-B）。
图3
为了探究MACF1是否通过互作蛋白影响成骨分化，课题组在小鼠成骨细胞MC3T3-E1中敲低了CDK12，然后检测结果显示敲低CDK12后会促进碱性磷酸酶ALP的活性，促进骨矿化，同时上调Runx2和Col1α1的表达，促进Runx2和Osterix的蛋白水平升高(图3 C-E)。
图3
此外敲低CDK12后会显著上调转录因子TCF7和LEF1的表达及蛋白水平，促进TCF7/LEF1的转录活性（图3 F-H）。
在MC3T3-E1细胞中敲低LEF1，也得到同样的结果（图3 I-N）。
上述结果说明MACF1互作的蛋白CDK12及MEAF6是成骨分化的抑制因子，它们能抑制转录因子TCF7、LEF1的表达。
4. MACF1互作的转录因子TCF12和E2F6是成骨分化的抑制因子
此前有研究显示MACF1能定位在细胞核中，因此推测MACF1能直接与成骨分化相关的转录因子互作，为了验证这一假设，课题组分别针对敲低MACF1和对照的MC3T3-E1细胞进行了ChIP-seq检测，结果另人十分欣喜，敲低MACF1的细胞中，在转录起始位点附近出现了结合峰的富集，而对照组细胞则没有结合峰的富集，对敲低MACF1后的结合峰所在基因进行富集性分析，结果显示主要为Wnt信号通路（图4A-B）。该结果暗示当MACF1表达量较低时会与转录因子互作。
图4
对MACF1结合基序的分析显示，MACF1的结合基序与转录因子TCF12的结合基序重叠，其次是E2F6。进一步分析敲低MACF1的ChIP-seq数据，分别分析TCF12和E2F6的结合基序，结果显示在转录起始位点附近能检出TCF12和E2F6结合基序的富集，进一步证明低表达量的MACF1能促进TCF12和E2F6结合靶标基因的启动子区（图4C-E）。
图4
为了探究转录因子TCF12及E2F6在成骨分化中的作用，课题组分别敲低了TCF12及E2F6，检测结果显示敲低这2个转录因子能显著增加碱性磷酸酶ALP的活性，增加矿化结节的形成，促进Runx2和Col1α1的表达，促进Runx2和Osterix的蛋白升高（图4 F-H, L-N）。
图4
另外敲低TCF12或E2F6后会上调TCF7及LEF1的表达，促进TCF7及LEF1的转录活性（图4I, J, O, P, K, Q）。
图4
上述结果表明，TCF12和E2F6通过抑制TCF7和LEF1的表达实现成骨细胞分化的抑制，这与CDK12及MEAF6的抑制作用类似。
5. 高表达的MACF1会限制自身以及TCF12和E2F6滞留在细胞质中
上述结果显示低含量的MACF1能促进TCF12及E2F6在细胞核内与MACF1互作。细胞内的邻位连接技术Duolinker PLA也显示在细胞质中高含量的MACF1与TCF12及E2F6互作。在敲低MACF1的细胞中，细胞质中检测不到MACF1与TCF12及E2F6的互作（图5 A-B）。
图5
免疫荧光检测MACF1与互作蛋白的共定位，结果显示在正常细胞中MACF1与E2F6主要分布在细胞质中，而TCF12在细胞核与细胞质中都有分布。在敲低MACF1的细胞中，虽然MACF1的总量下降，但在细胞核中的数量增加了，同时增加的也有细胞核中TCF12和E2F6的数量（图5 C-D）。
图5
据此作者推测当MACF1表达增高时会将TCF12及E2F6阻滞在细胞质中，阻止其向细胞核内转位。通过检测细胞质及细胞核中MACF1、TCF12、E2F6的蛋白水平，结果显示在敲低MACF1后，细胞核内MACF1、TCF12和E2F6的蛋白水平明显升高（图5E-F）。
图5
基于上述结果显示，当MACF1表达高时，MACF1与微管蛋白及Factin细胞骨架结合，除了能帮助维持细胞骨架的正态分布，还阻滞了与MACF1互作的转录因子滞留在细胞质中。当MACF1表达降低时，细胞骨架结构改变，导致MACF1与微管蛋白及细胞骨架的结合变弱，同时促进与MACF1互作的转录因子入核。
6. MACF1通过抑制TCF12的功能促进TCF7的转录
通过分别构建TCF7以及TCF12的荧光素酶报告质粒，检测MACF1在成骨分化过程中对TCF12和TCF7转录活性的影响（图6A）。结果显示在对照细胞中，随着成骨细胞的分化，TCF12的转录活性逐渐降低，TCF7的转录活性逐步增加。而在敲低MACF1的细胞中，两者的活性趋势相反（图6B-C）。
图6
进一步的实验显示，当TCF12被敲除后，MACF1对TCF7的转录活性调控作用消失（图6D）。
图6
通过对TCF12和TCF7结合基因的功能富集性分析，发现TCF12结合基因主要富集在multicellular organismal development通路，而TCF7富集在骨矿化通路（图6E-F）。
图6
总结：
在这项研究中，作者揭示了细胞骨架蛋白MACF1调控成骨细胞分化的机制。当细胞内MACF1水平较高时，MACF1会与细胞骨架及微管蛋白结合，从而有效的隔离了细胞质中成骨分化相关的抑制因子，确保了成骨细胞的动态分化过程。当细胞内MACF1降低时，成骨分化相关抑制因子会核易位进入细胞核中，从而抑制成骨分化相关基因的转录（图7）。
图7
