Plant Cell | PAS-seq技术助力RNA加工复合体调控植物免疫研究

内容转载自【公众号 BioArt植物】，感谢支持！

2022年2月8日，上海师范大学王水课题组在The Plant Cell在线发表了题为CONSTITUTIVE EXPRESSER OF PATHOGENESIS-RELATED GENES 5 is an RNA-binding protein controlling plant immunity via an RNA processing complex研究论文。CPR5（CONSTITUTIVE EXPRESSER OF PATHOGENESIS-RELATED GENES 5）是25年前通过遗传筛选克隆到的一个植物免疫的负调控因子（Bowling et al., Plant Cell, 1997）。除了C端具有4~5个跨膜结构域以外，该蛋白不含已知功能的结构域，极大地阻碍了对其深入研究。该研究发现，CPR5是一个SR家族RNA结合蛋白，通过RNA加工复合体调控植物免疫。植物能够战胜种类繁多且不断变化的病原微生物，说明植物先天性免疫（innate immunity）系统具有可塑性。RNA加工是增加信号分子多样性的一个重要途径。CPR5将RNA加工和植物免疫两大生命基本过程联系起来，为揭示植物免疫可塑性调控的机理奠定理论基础。

 

免疫系统分为适应性免疫系统和先天性免疫系统。适应性免疫系统的受体基因来自于特化的免疫细胞，通过体细胞DNA同源重组产生无限的受体基因，而先天性免疫系统的受体基因来自于生殖细胞，数量是有限的、不变的。植物只有先天性免疫系统，目前已全基因组测序的植物，免疫受体基因数量都很有限，如拟南芥和水稻基因组分别含有~200和~500个NLR免疫受体基因。植物是如何以这样少的受体基因应对种类繁多且不断变异的病原微生物？迄今仍然是一个谜。

 

植物先天性免疫系统分为病原相关分子模式（PAMP）触发免疫（PTI）和效应子触发免疫（ETI）两个层次。病原微生物侵染植物以后，一方面植物细胞质膜上受体PRR识别PAMP后通过MAPK信号途径激活植物PTI；另一方面植物细胞内NLR受体识别效应子后触发比PTI更强的免疫反应ETI，常常伴有程序性细胞死亡（PCD），又叫超敏反应（HR）。近年来研究发现，植物PRR受体和NLR受体协同地调控植物免疫，激活的NLR受体形成一个抗性小体，迄今对NLR受体下游激活植物ETI的信号途径尚很不清楚。

植物NLR受体主要分为两种：CC-NLR和TIR-NLR，其下游信号分别由NDR1和EDS1传递。目前对EDS1的研究比较深入，病原微生物侵染植物后，形成一个EDS1/效应子/NLR受体的复合体，在核质之间穿梭。复合体在细胞核中促进ETI，而在细胞质中促进PCD，表明核膜在调控植物ETI中扮演着重要的角色。研究植物ETI的分子机制，可以利用两类突变体：一类是NLR受体自主激活突变体，另一类是PCD自主激活的类坏死突变体（LLM）。

NLR受体自主激活突变体中，研究最多的是snc1（suppressor of npr1, constitutive 1）突变体。SNC1是一个TIR-NLR受体，因为NBS和LRR结构域之间一个氨基酸的改变（谷氨酸-赖氨酸），使得突变的蛋白不再需要效应子就可以自主激活。通过筛选snc1突变体抑制子mos（modifier of snc1），发现了两个重要的信号途径参与植物ETI调控：（1）核质运输信号途径，包括核孔蛋白MOS3和MOS7，核输入蛋白MOS6和MOS14，以及核质之间RNA运输蛋白MOS11；（2）RNA加工信号途径，包括RNA剪接和修饰蛋白MOS2、NTC复合体和MOS12。

通过大量的遗传筛选找到了一些具有自主激活PCD的类坏死突变体（LLM），分为两类：第一类LLM突变体决定PCD的起始，如cpr5、acd6和ssi1等；第二类LLM突变体控制PCD的强度，如lsd1和acd1等。迄今还不清楚这些蛋白的功能以及它们之间调控的分子机理。cpr5是利用植物防御报告基因PR2:GUS筛选拟南芥cpr（constitutive expressor of pathogenesis-related genes）得到的一个LLM突变体，具有自主激活免疫和类似HR坏死的表型。RNA-seq分析野生型和cpr5突变体植物，发现受CPR5调控的差异表达基因（DEGs）与植物ETI相关的DEGs有74.9%重叠，而与植物PTI相关的DEGs只有约11.2%重叠，说明CPR5主要参与植物ETI的调控。

通过解析CPR5信号传递途径，发现了三个重要的信号途径参与植物ETI调控：（1）细胞周期信号途径。细胞周期的核心信号调控链CKI-RB-E2F在CPR5下游激活植物ETI（Wang et al., Cell Host & Microbe, 2014）。（2）核质运输信号途径。CPR5是一个新的核孔蛋白，通常形成同源二聚体，结合细胞周期核心调控因子CKI并抑制免疫信号分子的核质运输。植物受到病原菌侵染以后，激活的NLR受体改变CPR5构象，使其二聚体解聚为单体，一方面释放CKI，另一方面开放免疫信号分子的核-质运输，两方面相结合激活植物ETI（图1）（Dasso and Fontoura, Cell, 2016; Gu et al., Cell, 2016）。（3）RNA加工信号途径。遗传分析发现RNA剪接因子NTC和RNA poly(A)加尾因子CPSF协同地在CPR5下游激活植物ETI（Peng et al., Plant Cell, 2022）。因此，遗传解析无论是SNC1还是CPR5的信号传递都揭示植物ETI受核质运输和RNA加工两个基本生命过程的调控。

图1 NLR受体激活后，改变核孔蛋白CPR5的构象，一方面打开核孔促进免疫信号分子向核内运输，另一方面释放细胞周期核心调控因子CKI，两个方面结合激活植物ETI及其相伴的PCD（摘自Dasso and Fontoura, Cell, 2016）。

尽管植物基因组中大多数的基因受到RNA加工的调控，如拟南芥基因组中，61%基因具有RNA可变剪接和75%基因具有RNA可变poly(A)加尾，但是迄今对RNA加工调控植物免疫还知道得很少。NTC是RNA剪接体的激活因子，由8个核心蛋白组成，包括Prp19，CDC5L， PRL1，AD-002，SPF27，DAM1，CTNNBL1和HSP73。其中的Prp19，CDC5L，PRL1和SPF27四个成员已被发现在SNC1下游激活植物免疫。植物免疫过程中一些NLR基因发生RNA可变剪接，如烟草的N基因、拟南芥的RPS4基因和SNC1基因等。NLR家族基因可能是RNA可变剪接的热点靶基因，拟南芥全基因组基因平均转录本约为2.40，而NLR家族基因平均转录本约为3.38。病原微生物的一些效应子可以直接结合RNA剪接因子调控植物免疫。如HopU1是一个ADP糖基转移酶，糖基化GRP7蛋白RNA结合结构域RRM中两个精氨酸残基，阻断GRP7结合植物细胞表面PRR受体FLS2和EFR基因的转录本，从而抑制植物PTI。

除了可变剪接，RNA可变poly(A)加尾也调控植物免疫，特别是调控CPR5信号传递途径。RNA poly(A)加尾复合体包含PAPS，CPSF，CFIm，CFIIm和CSTF。CPSF复合体又包含CPSF160，CPSF100，CPSF73，CPSF30，FIP1和WDR33。拟南芥含有4个PAPS基因。PAPS1是一个负的植物免疫调控因子。paps1突变体中自主激活的免疫反应可被eds1或pad4抑制。RNA-seq分析表明paps1突变体的DEGs和cpr5突变体的DEGs大多数都重叠。CPSF30是CPSF复合体的一个核心成员。cpsf30突变体可抑制cpr5，lsd1和mpk4突变体的细胞死亡。

王水团队通过遗传筛选发现PRL1和FIP1在CPR5下游激活植物免疫。PRL1和FIP1分别是RNA剪接因子NTC复合体和RNA poly(A)加尾因子CPSF复合体的核心成员。进一步遗传分析两个复合体的其它核心因子，表明整个NTC复合体和CPSF复合体都在CPR5下游激活植物免疫。采用BiFC-YFP、Co-IP和FRET-FLIM等分析表明CPR5、PRL1和FIP1形成一个复合体，共定位于RNA加工细胞器核斑点。通过不同植物蛋白序列比较和结构域功能替换，发现CPR5是一个SR家族Tra2亚家族RNA结合蛋白。Tra2亚家族是一类非典型的SR家族蛋白，具有SR-RRM结构域排列次序（RNA识别结构域RRM排列在SR结构域之后）。典型的SR家族蛋白具有RRM-SR结构域排列次序（RRM排列在SR结构域之前）。RNA-seq分析发现473个受CPR5调控的RNA可变剪接基因（ASGs）。AGO1是其中的一个ASG，ago1突变体可以抑制cpr5突变体免疫反应和PCD表型，表明AGO1在CPR5下游激活植物免疫。因此，本文的研究揭示了：1）CPR5是一个SR家族RNA结合蛋白；2）RNA剪接因子NTC和RNA poly(A)加尾因子CPSF协同调控植物免疫；3） CPR5将RNA加工和植物免疫两大基本的生命过程联系起来（图2）。

图2 CPR5通过RNA剪接因子PRL1和RNA poly(A)加尾因子FIP1调控植物免疫。（A）PRL1（SCPR44）和FIP1（SCPR57）在CPR5下游激活PCD（箭头指示子叶早衰）。（B）PRL1和FIP1协同调控植物ETI（左）和基础免疫（右）。（C）BiFC-YFP分析CPR5、SR34、PRL1和FIP1亚细胞共定位。SR34，指示核斑点位置；mCherry-NLS，指示细胞核位置；NS，核斑点。（D）CPR5蛋白N端的SR结构域，不同植物CPR5蛋白序列比较。（E）SR家族Tra2亚家族（包括人类RNPS1以及拟南芥CPR5、SR45和SR45a蛋白）蛋白结构示意图（SR、RRM和TM结构域）（摘自Peng et al., Plant Cell, 2022）。

王水团队近年来的一系列解析CPR5信号调控途径的研究，揭示CPR5作为一个SR家族RNA结合蛋白，是迄今发现的第一个免疫信号因子，将核质运输、细胞周期和RNA加工三大基本生命过程整合在一起调控植物免疫（图3）（Wang et al., Cell Host & Microbe, 2014；Gu et al., Cell, 2016；Peng et al., Plant Cell, 2022）。因此，cpr5突变体将是解析植物ETI信号传递的一个重要遗传工具。

图3 CPR5是一个RNA结合蛋白，既是核孔复合体（NPC）的一个成员，也是核斑点的一个成员。一方面激活的NLR受体改变CPR5蛋白构象，促进免疫信号分子向核内运输，同时释放细胞周期核心调控因子CKI。另一方面CPR5在核斑点和NTC/CPSF形成复合体，核内免疫信号因子和CKI一起解除CPR5对NTC/CPSF复合体的抑制，调控RNA可变剪接，形成编码全长或部分蛋白的转录本，两者的比例调控植物免疫和发育之间的平衡。

上海师范大学生命科学学院博士生彭顺和硕士研究生郭东北、郭缘为论文的共同第一作者，王水研究员为论文的通讯作者。河南大学生命科学学院蔡应繁教授和武汉瑞兴生物科技有限公司陈栋老师参与了本论文研究。该研究受到国家自然科学基金、上海植物种质资源工程技术研究中心和上海市植物分子生物学重点实验室等项目的资助。

原文连接：

https://academic.oup.com/plcell/advance-article/doi/10.1093/plcell/koac037/6524637#