microRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，其在细胞内具有多种重要的调节作用。MicroRNA存在多种形式，最原始的是primary miRNA （pri-miRNA），长度大约为300~1000个碱基；pri-miRNA经过一次加工后，成为precursor miRNA（pre-miRNA）即microRNA前体，长度大约为70~90个碱基；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20~24nt的成熟miRNA。
miRNA介导的RNA翻译抑制是通过Argonate（Ago）蛋白来实现的，其可以抑制mRNA的翻译或RNA诱导沉默复合体（RISC）中的靶mRNA的稳定性。RISC包括成熟miRNA和Ago蛋白，其结合靶mRNA的3’UTR的部分互补序列，是miRNA发挥作用的主要部位。利用Ago2抗体进行RNA免疫沉淀，结合高通量测序，可提高准确性，减少miRNA特异性靶向的转录本识别范围。
武汉瑞兴生物 RIP技术介绍
RIP技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀)，是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助发现miRNA的调控靶点。RIP技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP是染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同(如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等)。RNA免疫共沉淀测序(RIP-seq)，将RIP与新一代测序技术结合起来，在基因组范围内发现与蛋白或蛋白复合物相结合的RNA。
实验原理：
- 用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。
- 防止非特异性的RNA的结合。
- 免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。
- 结合的RNA序列通过microarray(RIP-Chip)，定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。
通过解读以下文献，和大家一起分享RIP-seq技术在miRNA研究中的价值。本研究成果于2021年10月21日发表在国际顶级杂志Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology上面（2020 IF 9.225，中科院一区，Top期刊）。
▲miRNA-31在APAP诱导的肝损伤中的保护作用：JNK信号通路的负调控因子
研究背景
持续的c-Jun N末端激酶(JNK)激活在药物性肝损伤(DILI)中起重要作用。应激反应的microRNA-31 (miR-31)参与调节不同的细胞损伤，JNK激活可诱导miR-31的表达。然而，miR-31在DILI中的调控作用尚未被研究。我们的目的是研究miR-31是否可以改善DILI，并确定其潜在的分子机制。
研究方法和主要发现
采用miR-31基因敲除(31-KO)和C57BL/6J野生型小鼠构建对乙酰氨基酚(APAP)诱导的DILI模型。采用小鼠原代肝细胞和小鼠肝细胞系 (AML-12)进行体外实验。通过Ago 2相关RNA免疫沉淀结合高通量测序来识别miR-31的特异性靶点。
RNA免疫沉淀结合高通量测序的生物信息学分析发现，JNK信号上游分子细胞分裂周期蛋白42 (Cdc42)是miR-31的特异性靶点，可形成miR-31/Cdc42/磷酸化混合谱系激酶3 (p-MLK3)负反馈环，限制JNK过度活化。
展示作者所研究部分图例：
图1 通过Ago2 RIP-seq获取miR-31的靶标mRNA。（A）Ago2 RIP-seq流程图。（B）miR-31靶标筛选策略。（C）RIP-seq中Ago2结合Cdc42的peak峰图。（D）APAP诱导DILI模型小鼠中，miR-31敲除后促进Cdc42的表达。（E）APAP诱导DILI细胞模型中，miR-31敲除后促进Cdc42的表达。（F）APAP诱导DILI模型小鼠中，JNK上游信号通路中p-MLK3和p-MLK4表达上调。（G）APAP诱导DILI细胞模型中，转染miR-31的inhibitor后，p-JNK以及JNK上游信号通路中p-MLK3和p-MLK4表达上调。（H）双荧光素酶报告基因实验验证miR-31与Cdc42靶向关系。（I）APAP诱导DILI细胞模型中，敲低Cdc42后p-JNK表达下调。（J）将I中细胞进行流式检测细胞坏死情况。
miR-31通过下调Cdc42抑制APAP诱导DILI肝细胞ROS/JNK/线粒体的过度激活的分子调控机制模型图。
总结
这项研究表明JNK/miR-31/Cdc42的反馈调节在维持肝细胞稳态中具有重要作用。运用RIP-seq检测技术，发现miR-31通过结合并抑制Cdc42的表达和活性，抑制JNK的激活，从而缓解肝细胞损伤。因此可以推测，miR-31可能具备作为药物传递分子来增强药物对抗APAP诱导的DILI的治疗潜力。
参考文献
