2005年诞生的高通量测序技术，使得研究人员可以在一次实验中完成对数以百万条的核酸序列进行同步测序。高通量测序技术作为一种基础性的测序技术，除了实验成本低廉，更重要的是可以在指定环境、病理样本或特定的实验设计下，测定出生物体中核酸序列的全局情况。转录组测序技术是高通量测序中最经典的应用之一。相较于静态的基因组，基因的转录及转录后加工会随着病理、生理环境的变化而变化，转录组测序技术可以快速、全面的捕获到动态变化过程中某一时刻的快照，快速地帮助医学研究人员发现疾病相关的蛋白质编码和非编码转录本！
真核生物中RNA的可变剪接现象虽然早在上世纪七十年代就被发现，但真正在全基因组水平大规模深入研究还是在高通量测序技术问世之后。尤其是转录组技术使得医学工作者可以整体分析病理样本中，经可变剪接加工产生的异常转录本的实时动态情况，成本低廉的转录组测序技术已成为生物医学研究中普遍应用的实验技术之一。
可变剪接分析流程ABLas pipeline的介绍
RNA的可变剪接（Alternative Splicing, AS）调控广泛存在于真核生物中，是真核生物运行其复杂生物过程的重要调控因素。通过该过程可以从单个基因中产生多种不同的功能转录本（transcripts）和不同的蛋白质。可变剪接产生的多个转录本在肿瘤生物学，诸如增殖、凋亡、血管发生、药物抵抗、侵袭和转移等方面具有不同的作用。在癌症中，可变剪接产生的不同蛋白质亚型在许多病理生理过程中发挥功能。我司开发的可变剪接分析流程ABLas pipeline能筛选和分类可变剪接事件，并生成可视化图。下面我们就通过一个案例一起来看如何在疾病研究中分析差异可变剪接转录本的功能吧！
通过解读以下文献，分享如何利用转录组测序技术分析可变剪接事件在慢性髓系白血病研究中的运用。
转录组分析揭示了慢性髓系白血病中hnRNPA1的8号外显子异常剪接
研究背景
慢性髓系白血病是一种骨髓增生性疾病，已有研究显示可变剪接事件已成为促进白血病进展和治疗耐药性的重要驱动因素。RNA结合蛋白hnRNPA1是辅助剪接因子，伴随真核生物的pre-mRNA的代谢，调节剪接位点的选择，促进成熟mRNA的转运，调控mRNA的翻译。
研究方法和主要发现
前期研究显示异常的剪接模式与疾病的进展相关。我公司自主开发的ABLas pipeline分析流程能更准确和系统地检出复杂的可变剪接事件生成统计报表，同时鉴定新的可变剪接事件并进行定量，流程具有可视化模块可输出可变剪接事件的可视化图。转录组技术结合可变剪接分析能进一步解析疾病进展过程中异常的剪接模式。
本研究中首先对5名慢性期白血病患者，5名急变期白血病患者和5名作为对照的健康人的外周血PBMC进行转录组测序。采用我司自主开发的可变剪接事件分析流程ABLas，检出已知的可变剪接事件14483，占已注释的可变剪接事件的35.6%，此外还检出53183个新的可变剪接事件。这些可变剪接事件所在的基因主要与细胞分化、白血病干细胞生成相关。为了更好地识别白血病进展相关的可变剪接事件，研究者通过t-test检验比较了慢性期患者和急变期患者的剪接模式（p-value ＜0.05），与正常对照相比，急变期患者表现出更显著的剪接失调（慢性期患者检出3456个差异可变剪接事件，急变期患者检出4222个差异可变剪接事件）。相较慢性期患者，急变期白血病患者中差异可变剪接事件显著富集在剪接体相关通路，其中包括剪接体以及剪接体组装相关的基因，例如SF3B2、hnRNPA1、hnRNPC、hnRNPK等。说明可变剪接调控相关基因的失调在一定程度上促进了疾病的发展。作者随后对其中一个基因hnRNPA1的可变剪接事件进行了验证，发现在患者中hnRNPA1的8号外显子被更多的保留下来，形成两种不同的蛋白亚型，在患者中多表现为较长的A1-b亚型，该蛋白分子量38kD，能影响mRNA的核质运输。
展示作者所研究部分图例：
总结：
这项研究利用转录组测序技术揭示了不同时期慢性髓系白血病患者的转录图谱。运用ABLas可变剪接分析流程比较了两类患者中的可变剪接调控模式，急变期白血病患者表现出更显著的剪接失调。筛选出辅助剪接因子hnRNPA1可作为区分白血病患者和健康人的的生物标志物。实验证明hnRNPA1的全长剪接亚型A1-b在急变期患者中表达明显升高，这种独特的表达模式可能为白血病急慢性患者的分类提供新的预后指标。
参考文献
Li, S.Q., Liu, J., Zhang, J., Wang, X.L., Chen, D., Wang, Y. et al. (2020). Transcriptome profiling reveals the high incidence of hnRNPA1 exon 8 inclusion in chronic myeloid leukemia. J Adv Res, 24, 301-310.
