ChIRP技术和实验原理介绍
ChIRP是基于通过平铺反义寡核苷酸亲和探针来捕获靶lncRNA-染色质复合体，然后以几百个碱基的分辨率生成具有高灵敏度和低背景的基因组结合位点图。ChIRP方法适用于许多lncRNA，因为在给定RNA序列的情况下，亲和探针的设计是直接的，并且不需要了解RNA的结构或功能域。
上图为ChIRP过程的流程图。染色质在体内与lncRNA和蛋白质混合物交联。将生物素化的杂交探针与靶lncRNA杂交，使用磁性链霉亲和素珠纯化染色质复合物，然后进行严格洗涤。我们用RNase A和H的混合物洗脱lncRNA结合的DNA或蛋白质；假定的lncRNA连接序列以橙色图示 (Chu, Quinn et al. 2012)。
产品优势
ChIRP是研究lncRNA功能机制的强有力手段，由于lncRNA存在以下特点：
1.lncRNA的序列保守性比较差
2.空间折叠结构不太好预测
3.RNA和DNA的相互作用并不完全靠序列互补配对来完成的。
因此，lncRNA在核内转录调控机制的方法学从生物信息预测的角度来讲比较难以预测，ChIRP就是为解决此类需求而开发的实验方法。
1.lncRNA的序列保守性比较差
2.空间折叠结构不太好预测
3.RNA和DNA的相互作用并不完全靠序列互补配对来完成的。
因此，lncRNA在核内转录调控机制的方法学从生物信息预测的角度来讲比较难以预测，ChIRP就是为解决此类需求而开发的实验方法。
为了有力地捕获lncRNA，ChIRP使用的探针是120-nt的长探针，长探针拥有降低背景噪音的优势。ChIRP技术不需要对染色质相互作用中涉及的lncRNA结合域有事先了解认知，在整个目标RNA上平铺寡聚核苷酸，使所有潜在的杂交位点都被充分利用，以确保即使在广泛的蛋白质- RNA相互作用、RNA二级结构或部分RNA降解的情况下也能对目标RNA及其结合的蛋白质和DNA进行捕获。
ChIRP的实验操作步骤
1. 探针设计：设计反义DNA拼接探针，用于通过ChIRP选择性提取RNA靶标；
2. 收集细胞：收获用于ChIRP实验的细胞；
3. 对细胞进行交联，并收集细胞颗粒：用戊二醛交联收集的细胞，以保存RNA染色质相互作用，并制备细胞颗粒；
4. 细胞裂解：裂解交联细胞制备细胞裂解液；
5. 超声处理：通过超声处理交联细胞裂解物来剪切DNA；
6. ChIRP：将生物素化DNA探针与RNA杂交并分离结合染色质；
7. RNA分离：从ChIRP样本中提取RNA部分，通过RT-qPCR进行定量，以确定富集效率，并通过测序或定量PCR进行鉴定；
8. DNA分离：从ChIRP样本中提取DNA片段，通过测序或定量PCR进行鉴定；
9. 蛋白质分离：从ChIRP样本中提取蛋白质，通过质谱或WB实验进行鉴定。
2. 收集细胞：收获用于ChIRP实验的细胞；
3. 对细胞进行交联，并收集细胞颗粒：用戊二醛交联收集的细胞，以保存RNA染色质相互作用，并制备细胞颗粒；
4. 细胞裂解：裂解交联细胞制备细胞裂解液；
5. 超声处理：通过超声处理交联细胞裂解物来剪切DNA；
6. ChIRP：将生物素化DNA探针与RNA杂交并分离结合染色质；
7. RNA分离：从ChIRP样本中提取RNA部分，通过RT-qPCR进行定量，以确定富集效率，并通过测序或定量PCR进行鉴定；
8. DNA分离：从ChIRP样本中提取DNA片段，通过测序或定量PCR进行鉴定；
9. 蛋白质分离：从ChIRP样本中提取蛋白质，通过质谱或WB实验进行鉴定。
样本准备和要求
组织：≥1500mg
细胞：≥300ul干体积
细胞：≥300ul干体积
ChIRP应用案例
应用案例一——LncRNA Khps1 通过招募蛋白对转录调控的影响
LncRNA Khps1通过招募组蛋白乙酰转移酶p300/CBP到SPHK1的启动子区域，改变染色质的结构（ChIRP方法，RAP-MS方法，RIP方法），进而促使E2F1启动对SPHK1的转录激活。在分子机制上，这是通过将Khps1与SPHK1转录起始位点上游的高嘌呤片段直接结合而实现的，后者形成DNA-RNA三联体，将lncRNA和相关效应蛋白锚定在基因启动子上。E2F1是LncRNA Khps1和SPHK1共同的转录因子，E2F1可以促进Khps1和SPHK1的转录(Postepska-Igielska, Giwojna et al. 2015)。
应用案例二——LncRNA CRLM1通过和HnRNPK互作来促进结直肠癌转移
本研究对转移性结直肠癌、原发性结直肠癌和正常组织中的lncRNA表达动态进行了研究，确定了一系列与转移相关的lncRNAs，包括CRLM1。CRLM1抑制细胞凋亡，并促进Balb/C裸鼠的肝转移。CRLM1与参与细胞粘附和DNA损伤的基因的染色质区域弱相关（ChIRP方法），并且这种关联与CRLM1调节的前转移基因表达双向相关。CRLM1与hnRNPK蛋白物理相互作用并促进其核定位（ChIRP-MS方法，RIP方法，共定位方法）。CRLM1有效增强HNRNPK启动子的占有率，并共同调节一组转移基因的表达 (Wang, Chen et al. 2022)。
参考文献
Chu, C., J. Quinn and H. Y. Chang (2012). ``Chromatin isolation by RNA purification (ChIRP).`` J Vis Exp(61).
Engreitz, J. M., K. Sirokman, P. McDonel, A. A. Shishkin, C. Surka, P. Russell, S. R. Grossman, A. Y. Chow, M. Guttman and E. S. Lander (2014). ``RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites.`` Cell 159(1): 188-199.
Hacisuleyman, E., L. A. Goff, C. Trapnell, A. Williams, J. Henao-Mejia, L. Sun, P. McClanahan, D. G. Hendrickson, M. Sauvageau, D. R. Kelley, M. Morse, J. Engreitz, E. S. Lander, M. Guttman, H. F. Lodish, R. Flavell, A. Raj and J. L. Rinn (2014). ``Topological organization of multichromosomal regions by the long intergenic noncoding RNA Firre.`` Nat Struct Mol Biol 21(2): 198-206.
McHugh, C. A., C. K. Chen, A. Chow, C. F. Surka, C. Tran, P. McDonel, A. Pandya-Jones, M. Blanco, C. Burghard, A. Moradian, M. J. Sweredoski, A. A. Shishkin, J. Su, E. S. Lander, S. Hess, K. Plath and M. Guttman (2015). ``The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.`` Nature 521(7551): 232-236.
Munschauer, M., C. T. Nguyen, K. Sirokman, C. R. Hartigan, L. Hogstrom, J. M. Engreitz, J. C. Ulirsch, C. P. Fulco, V. Subramanian, J. Chen, M. Schenone, M. Guttman, S. A. Carr and E. S. Lander (2018). ``The NORAD lncRNA assembles a topoisomerase complex critical for genome stability.`` Nature 561(7721): 132-136.
Postepska-Igielska, A., A. Giwojna, L. Gasri-Plotnitsky, N. Schmitt, A. Dold, D. Ginsberg and I. Grummt (2015). ``LncRNA Khps1 Regulates Expression of the Proto-oncogene SPHK1 via Triplex-Mediated Changes in Chromatin Structure.`` Mol Cell 60(4): 626-636.
Wang, Z., J. Chen, F. Sun, X. Zhao, Y. Dong, S. Yu, J. Li and H. Liang (2022). ``LncRNA CRLM1 inhibits apoptosis and promotes metastasis through transcriptional regulation cooperated with hnRNPK in colorectal cancer.`` Cell Biosci 12(1): 120.
B
