1.CLIP-seq建库流程

2.CLIP-seq分析流程

3.CLIP-seq详细分析流程

3.1 数据基础分析:

  1. 测序质量分析;
  2. 测序有效长度分析;
  3. cDNA文库的代表性分析。

3.2 全基因组定位分析:

  1. Reads与参考基因组比对分析;
  2. Reads在基因组不同区域分布情况;
  3. Reads的Rfam分类分析;
  4. Reads在gene/mRNA区分布分析;
  5. Reads在转录起始位点(TSS)附近的分布分析;
  6. Reads在转录终止位点(TTS)附近的分布分析;
  7. Reads在翻译起始位点(Start codon)附近的分布分析;
  8. Reads在翻译终止位点(Stop codon)附近的分布分析。

3.3 CLIP-seq高级分析:

在这部分分析中,我们开发的分析策略为:In silico random IP(仅使用unique reads进行分析,见下图)。对选定的基因中,根据定位到此基因的observed tag number with observed length产生随机序列,对此基因进行模拟定位500次,找出500次中maximal random tag height (p_value<0.01),如果此基因中observed max peak height
3.4 高级分析主要包括:

  1. 基因组上结合峰(peak)分布情况;
  2. 结合峰的峰宽分析;
  3. 结合峰的峰间距分析;
  4. IP样本特异结合峰(specific peak)分析(与对照样本相比较);
  5. 结合基序(motif)分析;
  6. 结合峰所在基因分析;
  7. 结合峰所在基因的GO分类分析;
  8. 结合峰所在基因的功能聚类分析(DAVID);
  9. 结合峰所在基因的GO富集性分析;
  10. 结合峰所在基因的KEGG分析。

4.CLIP-seq分析结果展示



Fig1: Unique Mapped reads distribution across TSS and TTS

Fig2: Unique Mapped reads distribution across Start codon and Stop codon.

Fig3: Statistics of the length of the identified peaks.

Fig4: Distance between peaks.

Fig5: Peak location in genes/mRNA normalized to 100% in length.

7月31日,国际著名期刊Cell报道了关于肌肉细胞分化过程中miRNA对线粒体中蛋白翻译系统调控的最新研究成果,我公司首席科学家张翼博士参与了该项目的指导研究。

MicroRNAs (miRNAs)是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,通常情况下,它能与mRNA的特定位点结合,在胞浆中导致mRNA的降解或抑制蛋白质的合成。近年也有研究表明, miRNAs在特定细胞环境中也能促进基因转录与表达,如血浆饥饿细胞。

线粒体是一种存在于大多数真核细胞中的半自主细胞器,它通过氧化磷酸化合成ATP,为细胞的活动提供了能量。除了为细胞供能外,线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程,并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。

miRNAs的表达具有明显的组织特异性和发育阶段特异性。在这篇文章中,研究人员发现了一种在肌肉生长过程中特异性诱导表达的miRNA——miR-1,它能有效地进入到线粒体中,并出乎意料地刺激了线粒体基因组编码的特异性转录物翻译。

他们发现这种正效应需要特异性的miR:mRNA碱基配对和Ago2,并通过CLIP-seq技术证实了Ago2对线粒体基因表达发挥直接作用。在胞质中,miR-1与Ago2和GW182家族蛋白组成的RNA沉默复合体,抑制靶基因转录。但是,当肌细胞处于生长或分化等特殊时期,miR-1就会同Ago2蛋白一起,进入到线粒体基质中,但GW182家族蛋白则无法一同进入,且由于线粒体DNA所转录的mRNA没有5’帽子结构,在线粒体内miR-1-Ago2复合体不再是抑制基因转录,它会结合到ND1、COX1等基因的mRNA上,增强它们的翻译能力。

原文检索:

Zhang XZuo XYang BLi ZXue YZhou YHuang JZhao XZhou JYan Y et al (2014) MicroRNA directly enhances mitochondrial translation during muscle differentiation. Cell 158, 607–619.