技术简介

DNA pull down是体外条件下研究目标DNA片段与蛋白质相互作用的技术。DNA pull-down以感兴趣的DNA序列为中心,寻找与该序列结合的蛋白质,最常见的应用是验证启动子与转录因子的互作情况。首先在体外制备带有生物素标记的DNA探针,DNA探针可以结合到链霉亲和素磁珠上,再将DNA探针-磁珠与细胞裂解液孵育,这样DNA结合蛋白便一起吸附在磁珠上;洗涤掉未结合的蛋白后,再用洗脱液将DNA结合蛋白从磁珠上洗脱下来,得到DNA pull down产物。该DNA-蛋白复合物既可以使用Western Blot方法来检测已知蛋白,也可以用质谱方法鉴定未知蛋白。

产品优势

√ 探针长度设计范围广;
√ 蛋白提取自新鲜组织和细胞,保持天然构象;
√ 特异性强,假阳性率低;
√ 适用于真核生物和原核生物;
√ 实验周期短,高通量,高灵敏度;
√ 富集分析低丰度蛋白;
√ 获得特异性蛋白与下游蛋白质检测技术兼容;

应用领域

√ 基因调控研究:

DNA pull-down技术可用于研究转录因子与基因启动子的结合,揭示基因调控机制和转录调控网络。这对于理解基因表达调控、发育过程和疾病发展等具有重要意义。

√ 信号转导通路研究:

DNA pull-down技术可以用于研究信号转导通路中的关键蛋白质与DNA的相互作用,如激活因子、抑制因子等,有助于阐明信号转导机制和调控网络。

√ 疾病机制研究:

DNA pull-down技术可用于研究与疾病相关的基因突变位点或调控元件的结合蛋白,帮助揭示疾病的发生和发展机制,为疾病的诊断和治疗提供理论依据。

√ 药物开发与筛选:

DNA pull-down技术可以用于筛选与特定DNA序列结合的小分子化合物或药物,帮助寻找新的药物靶点和开发潜在的药物治疗方法。

√ 比较基因组学研究:

DNA pull-down技术可用于比较不同物种、不同组织或不同条件下的DNA-蛋白质相互作用,帮助理解基因组的进化、组织特异性和环境适应等方面的变化。

实验步骤及流程图

实验步骤如下:

1)DNA探针的制备;

2)DNA pulldown实验:链霉亲和素磁珠捕获DNA探针,形成DNA探针-磁珠,再与细胞裂解液孵育进行蛋白捕获;

3)蛋白质的检测和分析:Western Blot验证和质谱验证。

DNA pull down实验流程图

DNA pull down实验流程图

案例解析

案例1

研究通过双荧光素酶,ChIP,DNA pull down和RNA pull down,RIP等实验发现lnc-GD2H在肌肉再生中的作用:在成肌细胞增殖过程中,c-Myc蛋白与lnc-GD2H启动子结合并调节其转录,促进成肌细胞增殖;在成肌细胞分化过程中,lnc-GD2H与成肌细胞分化相关蛋白NACA相互作用,抑制其在Myog启动子的富集,减轻NACA对Myog的抑制作用,促进Myog表达和成肌细胞分化。

案例2

本研究报道了家蚕中调控丝素蛋白编码基因所必需的启动子相互作用蛋白(PIP),包括丝素重链(Fibre H)、丝素轻链(FiBL)和一个25kD的多肽蛋白(P25)。作者通过DNA pull down结合质谱分析鉴定与FibH、FiBL和P25启动子区域相互作用的蛋白质,研究首次提供了与丝素基因启动子相互作用的蛋白质的深入图谱,有助于更好地理解丝蛋白的合成调控。

参考文献

【1】Chen R. et al: Lnc-GD2H Promotes Proliferation by Forming a Feedback Loop With c-Myc and Enhances Differentiation Through Interacting With NACA to Upregulate Myog in C2C12 Myoblasts. Front Cell Dev Biol. 2021, IF=6.684.

【2】Ma Y. et al: New insights into the proteins interacting with the promoters of silkworm fibroin genes. Scientific Reports. 2021, IF=4.379.