技术简介

      1958年，克里克提出“中心法则”，阐述了DNA、RNA与蛋白质间的信息流动。基因转录成前体RNA，经过可变剪接形成不同转录本，进而翻译成蛋白质异构体。选择性剪接使基因产生多种异构体，具有不同的结构和功能，表达具有特异性。《Nature Reviews Drug Discovery》近期探讨了蛋白质异构体在药物发现中的作用，提出利用异构体增强药物特异性和效果。因此，研究前体RNA选择性剪接调节转录本及其翻译机制，对开发以蛋白质异构体为中心的治疗方法至关重要。Poly(A)尾是mRNA的关键结构元素，对mRNA的稳定性和翻译过程至关重要，但我们常忽视其背后的表观遗传调控机制。测序技术的进步使我们能够全面深入地分析poly(A)尾的长度和构成，揭示了其丰富的调控信息，为基因表达调控提供了新的视角和可能。

       以Nanopore为代表的第三代测序技术，因其对同源多聚序列的不敏感性，使得它们能够执行精确的poly(A)尾测序。Nanopore平台尤为突出，它不仅能够通过DRS测序得到polyA尾长度，也有一些研究者开发了适配ONT平台可以测序poly（A）尾长度的技术，比如FLEP-seq、FLEP-seq2以及Nano3P-seq等。目前Nanopore官方最新版的长读长转录组建库试剂盒也能够测序poly（A）尾长度，建库原理跟ONT-IrRNA-seq（Oxford Nanopore Technologies long-read RNA sequencing）不同，为了跟ONT-IrRNA-seq测序技术区分，我们将新版建库测序技术称为：ONT-PAIrRNA-seq（Oxford Nanopore Technologies Poly(A) inclusive long-read RNA sequencing ）。无论是通过cDNA测序还是DRS测序，Nanopore测序技术都能揭示poly(A)尾巴内的非A残基，这一特性为其在RNA研究领域的应用提供了强大的支持。

产品优势

  • 完善基因注释：发现新的转录本和基因，获得全面的转录组图谱。
  • 差异分析：差异表达基因（DEG）、差异表达转录本(DET)、差异使用转录本(DTU)。
  • 基因结构分析：准确分析可变剪接(AS)、多聚腺苷酸化位点（APA），3’UTR长度、polyA长度。
  • 转录本分辩率：在转录本水平上解析基因表达的调控机制及其功能。
  • 绝对定量：UMI序列能够非常准确定量转录本。

实验步骤及流程图

图2 实验流程图

       首先通过olig dT磁珠捕获获得含有polyA尾巴的RNA，接着使用T4 DNA连接酶将一段固定序列+6个T碱基突出的双链引物与RNA的3’末端最后一个A碱基连接起来，然后消解掉双链引物未被连接的那条链。接着加入RT引物逆转录，把TSO+UMI序列通过链置换方式添加到cDNA 3’末端，使用引物PCR扩增形成双链cDNA，最后将双链cDNA末端进行修平和连接ONT测序接头形成测序文库。

送样要求

详细信息请参考推文：送样规范 | 武汉瑞兴生物三代建库测序类相关产品送样取样建议

案例解析

Poly(A)尾是真核生物mRNA的重要标志，对mRNA代谢和翻译有重要作用。其长度由Poly(A)聚合酶和去腺苷化酶动态调控。尽管三代测序技术如Nanopore和PacBio推动了全基因组水平Poly(A)尾检测，但植物mRNA poly(A)尾信息仍然稀缺。南方科技大学翟继先副教授团队在Nature Plants发表了研究论文，揭示了植物全长度RNA图谱，展示了组织特异性和单子叶-双子叶植物共有的poly(A)尾长度调控。

       该团队前期基于Nanopore测序技术开发了一套对染色质结合的新生RNA进行全基因组水平全长测序的方法FLEP-seq，并用该方法发现拟南芥中存在广泛的转录后内含子剪接现象，细胞核中含有大量带有poly(A)但不完全剪接的mRNA。本研究中，作者优化了该方法，并将优化后的FLEP-seq2用于总RNA的研究。作者绘制了植物poly(A)图谱，包括了七种不同的拟南芥组织（幼苗、根、地上部分、叶、花序、种子、花粉）以及玉米、水稻、大豆的地上部分组织样品，每个样本有两个生物学重复。研究人员总共构建了20个FLEP-seq2文库，捕获了包括121M poly(A)+ RNA在内的共276M RNA分子。

      该研究指出植物poly(A)尾长度在约20至45nt处富集，暗示它们可能被一个或两个poly(A)结合蛋白(PABP)结合。花粉和种子中poly(A)尾长度分布不同，花粉中在55nt和80nt附近富集，可能与PABP调控和mRNA稳定性有关。研究还发现，短半衰期mRNA的poly(A)尾较长，而长半衰期mRNA的poly(A)尾较短，主要在45nt附近。这表明PABP结合的poly(A)尾对mRNA稳定性至关重要。细胞核中的poly(A)尾比细胞质中的长，表明新生RNA的poly(A)尾在出核过程中快速缩短。多物种比较分析显示，植物直系同源基因的poly(A)尾长度在物种间相对保守，表明其受自然选择影响。

       总的来讲，该研究详细绘制了多物种多组织的植物poly（A）尾图谱，为进一步研究顺式元件和反式因子调控植物poly（A）尾长度，以及poly(A)长度调控基因表达的机制奠定了重要基础。

参考文献

【1】 Kjer-Hansen, P., Phan, T.G. & Weatheritt, R.J. Protein isoform-centric therapeutics: expanding targets and increasing specificity. Nat Rev Drug Discov (2024).

【2】Jia, J., Lu, W., Liu, B. et al. An atlas of plant full-length RNA reveals tissue-specific and monocots–dicots conserved regulation of poly(A) tail length. Nat. Plants 8, 1118–1126 (2022).