RAP技术和实验原理介绍
RAP(RNA antisense purification)就是RNA反义探针捕获，通过设计目标RNA主要是lncRNA的反义探针，来捕获lncRNA；同时，捕获下来的产物可以是多种多样的。比如RAP-RNA，则是捕获和目标lncRNA互作的RNA；RAP-MS，则是捕获和目标lncRNA互作的蛋白质；RAP-DNA，则是捕获和目标lncRNA互作的DNA。
使用RAP-RNA`{`ATM`}`方法，4’-aminomethyltrioxalen (ATM)可以对直接的RNA-RNA互作进行交联。图中一致序列显示了典型的碱基配对相互作用。为了避免捕获间接相关的RNA，我们在用生物素化反义探针（蓝色）纯化U1之前消化了蛋白质和DNA。为了以高分辨率绘制RNA-RNA相互作用位点，我们在捕获之前将RNA片段化，并在不逆转交联的情况下进行逆转录（RT），从而产生终止于交联位点或其附近的互补DNA（cDNA，紫色）（另见图S1）。将第二个接头连接到cDNA的3’端，可以测序和绘制RT终止位置 (Engreitz, Sirokman et al. 2014)。
RAP-MS示意图概述 (Munschauer, Nguyen et al. 2018)。注意，这里使用了UV交联，能够捕获RNA-protein直接互作的复合物。
产品优势
RAP是研究lncRNA功能机制的强有力手段，由于lncRNA存在以下特点：
1.lncRNA的序列保守性比较差
2.空间折叠结构不太好预测
3.RNA和DNA的相互作用并不完全靠序列互补配对来完成的。
因此，lncRNA在核内转录调控机制的方法学从生物信息预测的角度来讲比较难以预测，RAP就是为解决此类需求而开发的实验方法。
1.lncRNA的序列保守性比较差
2.空间折叠结构不太好预测
3.RNA和DNA的相互作用并不完全靠序列互补配对来完成的。
因此，lncRNA在核内转录调控机制的方法学从生物信息预测的角度来讲比较难以预测，RAP就是为解决此类需求而开发的实验方法。
为了有力地捕获lncRNA，RAP使用的探针是120-nt的长探针，长探针拥有降低背景噪音的优势。RAP技术不需要对染色质相互作用中涉及的lncRNA结合域有事先了解认知，在整个目标RNA上平铺寡聚核苷酸，使所有潜在的杂交位点都被充分利用，以确保即使在广泛的蛋白质- RNA相互作用、RNA二级结构或部分RNA降解的情况下也能对目标RNA及其结合的蛋白质和DNA进行捕获。
实验步骤和送样要求
1. 探针设计：设计反义DNA拼接探针，用于通过RAP选择性提取RNA靶标；
2. 收集细胞：收获用于RAP实验的细胞；
3. 对细胞进行交联，并收集细胞颗粒
4. 细胞裂解：裂解交联细胞制备细胞裂解液；
5. 超声处理：通过超声处理交联细胞裂解物来剪切DNA；
6. RAP：将生物素化DNA探针与RNA杂交并分离结合染色质；
7. RNA分离：从RAP样本中提取RNA部分，通过RT-qPCR进行定量，以确定富集效率，并通过测序或定量PCR进行鉴定；
8. DNA分离：从RAP样本中提取DNA片段，通过测序或定量PCR进行鉴定；
9. 蛋白质分离：从RAP样本中提取蛋白质，通过质谱或WB实验进行鉴定。
2. 收集细胞：收获用于RAP实验的细胞；
3. 对细胞进行交联，并收集细胞颗粒
4. 细胞裂解：裂解交联细胞制备细胞裂解液；
5. 超声处理：通过超声处理交联细胞裂解物来剪切DNA；
6. RAP：将生物素化DNA探针与RNA杂交并分离结合染色质；
7. RNA分离：从RAP样本中提取RNA部分，通过RT-qPCR进行定量，以确定富集效率，并通过测序或定量PCR进行鉴定；
8. DNA分离：从RAP样本中提取DNA片段，通过测序或定量PCR进行鉴定；
9. 蛋白质分离：从RAP样本中提取蛋白质，通过质谱或WB实验进行鉴定。
样本准备和要求
组织：≥1500mg
细胞：≥300ul干体积
细胞：≥300ul干体积
RAP应用案例
案例一：LncRNA-Firre对染色体结构的影响
我们描述了一种lncRNA，Firre，它通过56bp的重复序列与核基质因子hnRNPU相互作用（RNA pulldown+MS方法），并定位在X染色体上的~5-Mb结构域（RAP-DNA方法）。我们进一步观察到Firre定位在五个不同的跨染色体基因座上（RAP-DNA方法），它们在空间上与X染色体上的Firre基因组基因座相邻（RNA FISH共定位方法）。Firre基因座的遗传缺失和hnRNPU的敲除均导致这些跨染色体相互作用基因座的共定位丢失 (Hacisuleyman, Goff et al. 2014)。
案例二：LncRNA Xist 调控女性一条X染色体转录沉默的机制
在这里，我们开发了一种从细胞中纯化lncRNA的方法，并使用定量质谱直接鉴定与其相互作用的蛋白质（RAP-MS方法）。我们鉴定了10种与Xist特异性相关的蛋白，其中三种蛋白SHARP、SAF-A和LBR是Xist介导的转录沉默所必需的。我们表明，与激活HDAC37的SMRT共阻遏物相互作用的SHARP不仅是沉默的必要条件，而且是从非活性X中排除RNA聚合酶II（Pol II）所必需的（RNA、蛋白共定位方法）。SMRT和HDAC3也是沉默和PolII排除所必需的。除了沉默转录外，SHARP和HDAC3是Xist介导的跨X染色体的多克隆抑制复合物2（PRC2）募集所必需的。
参考文献
Chu, C., J. Quinn and H. Y. Chang (2012). ``Chromatin isolation by RNA purification (ChIRP).`` J Vis Exp(61).
Engreitz, J. M., K. Sirokman, P. McDonel, A. A. Shishkin, C. Surka, P. Russell, S. R. Grossman, A. Y. Chow, M. Guttman and E. S. Lander (2014). ``RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites.`` Cell 159(1): 188-199.
Hacisuleyman, E., L. A. Goff, C. Trapnell, A. Williams, J. Henao-Mejia, L. Sun, P. McClanahan, D. G. Hendrickson, M. Sauvageau, D. R. Kelley, M. Morse, J. Engreitz, E. S. Lander, M. Guttman, H. F. Lodish, R. Flavell, A. Raj and J. L. Rinn (2014). ``Topological organization of multichromosomal regions by the long intergenic noncoding RNA Firre.`` Nat Struct Mol Biol 21(2): 198-206.
McHugh, C. A., C. K. Chen, A. Chow, C. F. Surka, C. Tran, P. McDonel, A. Pandya-Jones, M. Blanco, C. Burghard, A. Moradian, M. J. Sweredoski, A. A. Shishkin, J. Su, E. S. Lander, S. Hess, K. Plath and M. Guttman (2015). ``The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.`` Nature 521(7551): 232-236.
Munschauer, M., C. T. Nguyen, K. Sirokman, C. R. Hartigan, L. Hogstrom, J. M. Engreitz, J. C. Ulirsch, C. P. Fulco, V. Subramanian, J. Chen, M. Schenone, M. Guttman, S. A. Carr and E. S. Lander (2018). ``The NORAD lncRNA assembles a topoisomerase complex critical for genome stability.`` Nature 561(7721): 132-136.
Postepska-Igielska, A., A. Giwojna, L. Gasri-Plotnitsky, N. Schmitt, A. Dold, D. Ginsberg and I. Grummt (2015). ``LncRNA Khps1 Regulates Expression of the Proto-oncogene SPHK1 via Triplex-Mediated Changes in Chromatin Structure.`` Mol Cell 60(4): 626-636.
Wang, Z., J. Chen, F. Sun, X. Zhao, Y. Dong, S. Yu, J. Li and H. Liang (2022). ``LncRNA CRLM1 inhibits apoptosis and promotes metastasis through transcriptional regulation cooperated with hnRNPK in colorectal cancer.`` Cell Biosci 12(1): 120.
2.RAP-Seq-DNA
3.RAP-Seq-RNA
4.Probe Design
