什么是poly(A)？
1971年Edmonds就发现mRNA具有poly(A)尾巴，它是RNA转录后在其3’末端，通过非模板方式，由多种调控因子/酶添加的一连串的碱基，这些碱基绝大部分是A。poly(A)尾巴是绝大多数真核生物mRNA和长链非编码RNA的必要结构组分，对于RNA的转运、稳定性、翻译等至关重要。
技术背景
poly(A)尾是真核生物mRNA最重要的特征之一，通常被认为由腺苷酸（A）的简单重复组成。近几年，针对mRNA尾的高通量测序技术逐步被建立。我们可以看到建库起始用量正在逐步减少，从原来的100ug到现在的1-5ug样品。这真是对于稀有珍贵样品研究的福音呀！
基于二代测序的方法有PAL-seq (Subtelny et al., Nature 2014) ，TAIL-seq (Chang et al., Molecular Cell 2014)，TED-seq (Woo et al., Cell Reports 2018)。这三种方法中，PAL-seq(Subtelny et al., 2014)使用夹板寡核苷酸优先捕获聚腺苷酸，从而绕过rRNA去除。生物素标记的dUTP标记每个簇的长度与尾巴的长度成比例，通过不同poly(A)长度样品的标准曲线估计待测定mRNA的poly(A)尾长度。只有TAIL-seq是通过直接测序获得poly(A)的长度和序列，但是该技术是从3’端测序，测序质量很差，无法直接使用Illumina仪器给出来的碱基，需要使用测序仪的原始荧光信号用特殊程序来进行数据处理，这样一般的实验室都无法操作。
自主开发Poly(A)-seq技术介绍
我们团队开发的Poly(A)-seq是基于5’端测序的原理，测序质量很好，可以直接使用Illumina仪器给出来的碱基以及我们开发的pA-finder流程来获得每个基因的poly(A)长度，以及加尾位置。我们在HiSeq X Ten and NovaSeq 6000都做了测试，结果可信度非常可观。
与PAL-seq (Subtelny et al., Nature 2014) 和TED-seq (Woo et al., Cell Reports 2018) 相比，Poly(A)-seq和TAIL-seq拥有一个共同的优势：可以研究在动物中广泛存在的具有调控功能的mixed tailing（混合加尾）生物学现象。
最近的研究报道，poly(A)尾巴不都是腺苷序列，还有尿苷序列，而且尿苷化会降低mRNA的稳定性，而混合加尾则倾向于提高mRNA的稳定性(Chang et al., Molecular Cell 2014; Lim et al., Science 2018)。
案例介绍
该技术在拟南芥的poly(A)加尾调控项目的研究中得到应用，揭示了拟南芥poly(A)尾介导的全新转录后调控机制——在poly(A)尾中散在分布的鸟苷酸（G）可通过抑制与poly(A)结合蛋白（PAB）的相互作用降低mRNA的翻译效率。该研究成果发表在Genome Biology 上(Zhao et al., 2019)。
进一步结合CLIP-seq、ribo-seq和mRNA稳定性检测等高通量实验技术，在全基因组水平对poly(A)尾及其结合蛋白PAB的分子生物学功能进行了系统性研究，得出以下结论：
1、AtPAB广泛结合植物体内mRNA的poly(A)尾，但对不同mRNA的结合效率存在明显差异；
2、拟南芥中10%的poly(A)尾含有至少一个鸟苷（G），其含量在不同mRNA中的分布范围为0.8-28%；
3、AtPAB对不同mRNA的差异结合可以部分被其poly(A)尾中G含量的差异所解释——A的“纯度”越高，其与AtPAB的结合越强；
4、AtPAB对mRNA的结合可以提高mRNA的翻译效率；
5、相应的，在atpab 突变体中，带有不含G的“纯poly(A)尾”的mRNA翻译效率降低更为明显；
6、atpab2、atpab4、atpab8三突变体纯合致死，atpabs 的双突变体呈现多种发育异常表型，暗示了由poly(A)尾与其结合蛋白介导的翻译调节机制对植物的正常生长发育具有至关重要的调控作用。
该研究充分展示了二代测序技术与生物信息学算法的结合在解析生物大分子调控过程中的强大优势。其结果阐明了植物poly(A)尾中的G含量可通过抑制PAB结合影响蛋白翻译效率，是对近代分子生物学中心法则的拓展与创新。该研究对探究其他物种中mRNA的转录后调控机理具有重要参考价值。
Poly(A)-seq技术与最近兴起的三代测序研究poly（A）加尾调控形成重要的互补。与现有其它测定poly(A)的相关技术相比，我们的Poly(A)-seq技术拥有直接、便捷和容易实现、成本低、通量高、可信度高、信息量丰富等不可比拟的优势。
Poly(A)尾巴的长度和混合加尾（mixed tailing）可以调控mRNA的稳定性和翻译效率，是非常重要的生物学调控机制，在各种生理和病理状态下均发挥重要功能。以前由于方法学局限，对这一重要的调控机制研究很少。
我们预计Poly(A)-seq技术的方便性和稳定性会带给全球许多实验室新的机遇，推动一批创新性优秀成果的产出。我们希望我们团队提供的Poly(A)-seq技术服务可以惠及全国科研院所和医院的多个研究团队，助力各团队抓住这个新的科研机遇，产生创新性研究成果，实现新的突破。
