1.文章简介
| 文章题目 | Splicing of Nascent RNA Coincides with Intron Exit from RNA Polymerase II |
| 中文题目 | 新生RNA内含子剪切与RNA聚合酶II通过内含子同时发生 |
| 期刊名 | Cell IF: 28.71 |
| 发表时间 | 2016.03 |
| 单位 | Yale University |
| 实验材料 | budding yeast |
| 测序平台 | Illumina HiSeq2000/2500 |
| 相关产品 | 转录组测序 |
2.研究背景
Pre-mRNA的转录和剪切过程由两个不同的大分子复合物完成，RNA聚合酶II和剪接体。早期研究已经表明，新生RNA上能同时发生剪接行为，那么在新生RNA上发生的剪接过程，Pol II和剪接体之间的距离是多近是从未有人报道的。
3.研究方法
通过GRO-seq技术，研究RBFox2敲除鼠的心肌细胞中基因表达情况，揭示该因子与基因转录的相关性，同时，结合CLIP-seq和CHIP-seq，揭示RBFox2能够基因的新生RNA以及DNA序列，结合生物信息学方法，预测到RBFox2可能的关联通路，并且进行实验验证。很多研究结果表明，转录和剪接之间的互作调控对于基因表达有着重要的意义。大量研究对Pol II的合成速率进行研究，但是剪接效率的研究非常少。新生RNA同时蕴含Pol II 的位点信息和剪接信息，对于二者之间的关系提供了重要的时空信息。
研究思路和亮点
芽殖酵母中大量的基因仅含一个内含子，作者通过实验室开发的单分子内含子追踪（SMIT）技术，首次利用芽殖酵母对共转录剪接动力学进行研究，研究了Pol II合成与RNA剪接之间的时空逻辑关系。
4.研究成果
1.Single-molecule intron tracking (SMIT)检测剪接与Pol II位置之间的关系
通过染色质纯化分离新生RNA，在3’ 末端加上连接接头（此接头位置代表3’ 端Pol II 位置），通过特殊设计的针对目的基因第一个外显子设计的引物进行PCR扩增，选择性富集感兴趣的目的新生RNA，而后通过大规模平行配对双端测序检测RNA剪接状态。本项研究共检测了87个内源性酵母基因，代表约30%的包含内含子基因。通过剪接饱和曲线检测（剪接比例），大部分基因在转录还未到达polyA位点时已经全部剪切完成。提示剪切在转录过程早期就已在进行中。
2.长片段测序验证SMIT结果
鉴于SMIT测序过程中会对短序列有一定的偏好性，作者运用长片段测序方法对SMIT结果进行了验证，方法见下图。结果显示新生转录本的剪接3’ 端与Pol II位点非常临近，支持了SMIT的结论。
3.剪接动力学的in vivo定量
对所有SMIT测序的87个基因进行了剪接饱和度分析， 10%表示剪切起始，50%代表剪接完成一半，90%表示剪接全部完成。整合87个基因的数据发现， 起始剪接位点约位于Pol II上游26nt。处。长片段测序结果显示约为36nt，支持了SMIT的结果。两个独立实验证明剪接起始位点与Pol II位点时紧邻着的。
4.剪接动力学对剪接位点序列变异非常敏感
作者证明剪接位点的变异，影响剪接体的组装，同样在体内也会抑制剪接活性。5’SS 位点的变异导致剪接起始位点效率变低，与Pol II坐在位点偏移较远。
5.转录活性提高时的剪接速度限制
通过引入一个单个氨基酸位点突变的Pol II菌株，其转录效率较野生型加快约2.3倍，作者观察了剪接位点与Pol II的位置关系，发现起始剪接仍然离Pol II较近，但是饱和度50%和90%的位点离Pol II距离较野生型明显滞后，说明共转录剪接动力学对转录延长速率较为敏感，但是剪接可能成为一个限速步骤。
Carrillo Oesterreich F, Herzel L, Straube K, Hujer K, Howard J, Neugebauer KM. (2006) Splicing of Nascent RNA Coincides with Intron Exit from RNA Polymerase II.Cell., 165:372-81.
