1.文章简介
| 文章题目 | Argonaute CLIP Defines a Deregulated miR-122-Bound Transcriptome that Correlates with Patient Survival in Human Liver Cancer |
| 中文题目 | Ago蛋白CLIP实验确立了一个可以和人肝癌病人存活率相关的miR-122结合的去调控转录组 |
| 期刊名 | Molecular Cell, IF: 14.713 |
| 作者 | Joseph M. Luna, Juan M. Barajas, Kun-yu Teng, Hui-Lung Sun, Michael J. Moore, Charles M. Rice, Robert B. Darnell, and Kalpana Ghoshal |
| 发表时间 | 2017年8月3日 |
| 实验材料 | Mouse liver, human hepatocellular carcinoma (HCC) |
| 测序平台 | Illumina HiSeq 2500 |
| 相关产品 | CLIP-seq，RNA-seq |
2.研究背景
miR-122是一个肝脏组织特异表达的miRNA，长度在21-22 nt。miR-122通过和Ago蛋白的结合，会进一步结合到靶标基因的3’UTR上面，从而造成基因的转录后调控，会造成数百个基因的表达抑制。miR-122在肝脏中的功能研究已经比较多，尤其是在肝癌发生过程中的研究。miR-122的敲除并不会太大影响肝脏的发育和功能，但会造成年轻人的肝脏炎症反应以及脂肪肝，在年老人群中，会进一步引起肝癌。在肝癌病人中，前人也发现了miR-122的低表达。综合上述结果，miR-122被认为是一个抑癌因子，而且可以进一步作为肝癌治疗的一种药物靶点。但是到目前为止，miR-122在肝脏中的调控网络，以及作用的靶基因之间的关系还不是很完善。
通过CLIP技术，我们可以鉴定出miRNA的作用位点，因此可以获得miRNA的调控靶标以及作用方式。虽然miRNA的靶标作用位点可以通过生物信息学方法获得，但是这种方法不会考虑到细胞系或者组织的转录组信息，会丢失掉非经典的结合位点。但是CLIP加上测序（sequencing）的方法可以很好地弥补计算机预测的缺点。
本项研究中，我们使用Ago-CLIP的方法，系统鉴定了miR-122在肝脏组织中的靶标特点。发现了大量的经典和非经典的结合特征，获得了超过104个靶标位点。而且我们发现很多结合位点都是物种特异的。进一步分析和实验发现，其中的一个靶标，BCL9，是HCC发病机理中的一个很关键的因素。
3.研究内容
以小鼠肝脏组织和人的肝脏组织，以及肝癌细胞系为细胞模型，使用CLIP-seq技术，解析了miR-122的作用靶标和作用方式。同时对miR-122进行了敲除，系统研究敲除前后CLIP-seq Peak的不同。通过对靶标的分析，发现BCL9是HCC发病机理中的一个很关键的因素。
- 使用CLIP-seq技术系统鉴定了miR-122在小鼠和人肝癌细胞系中的结合位点；
- miR-122的结合位点具有广泛分布、非经典、物种特异等特性；
- miR-122在人肝癌细胞系中的结合位点揭示了一组核心的保守靶标；
- miR-122的保守靶标，尤其是BCL9，和肝癌病人的存活率是相关的
4.研究方法
本研究主要使用了CLIP-seq的技术方法，来获得miR-122在小鼠和人中的结合特点。
5.研究成果
1. 在小鼠肝脏组织中，miR-122的结合呈现广泛分布和非经典结合的特征
为了解析miR-122在小鼠肝脏组织中的特点，本研究在6个星期大的小鼠中，使用Ago-CLIP和RNA-seq技术，来获得miR-122的结合位点。对miR-122进行敲除，发现敲除前后CLIP-seq获得的peak有很大的不同，说明了敲除是成功的，而且结合位点是miR-122特异的。
我们筛选只在WT中出现的Peak作为miR-122的结合位点（图1A）。Motif富集性分析发现，除了经典的结合特征外，还有一个G凸起的位置（图1B）。靶标位点的分布是以AGO结合的Peak为中心进行分布的（图1C-D）。对所有的miRNA靶标位点进行统计发现，miR-122的靶标位点占了很大一部分（top 10 miRNA的18.7%，图1E）。对miR-122的靶标位点进行统计分析，发现除了3’UTR，CDS和内含子区域也占据了很大一部分（图1F）。总的来说，在肝脏组织中，miR-122占据了很大一部分的转录组，不管是经典的，还是非经典的结合模式。
图1. 在小鼠肝脏组织中，miR-122的结合靶标呈现非经典和广泛分布的特征。（A）miR-122依赖的Ago Peak位点的结果展示，分别展示了KO和WT的结果；（B）miR-122结合位点的motif富集性分析结果展示；（C-D）分布图展示了经典和非经典的结合位点都是以AGO Peak为中心进行分布的。（E）不同miRNA的结合位点的比例分布特征；（F）不同miRNA的靶标位点在基因组上的分布特征。
2. miR-122结合的转录组功能特征分析
为了进一步分析miR-122的敲除对细胞功能产生的影响，文章使用了RNA-seq的技术来研究转录组的变化。对miR-122敲除后，虽然发现了经典和非经典的结合位点上，Ago的结合强度都发生了显著的下降，但只有经典位点的基因的表达量发生了明显的变化（Figure 2A）。进一步分析发现，Ago的结合强度的降低是跟基因区域的注释没有关系的（Figure 2B），但是只在经典结合位点的CDS和3’UTR区域，mRNA的表达量发生了显著的变化（Figure 2C）。这些发现和之前的发现也是一致的。值得注意的是，虽然在miR-122-3p的靶标位点上Ago的结合强度明显降低，但这些mRNA的表达量却没有发生变化。
进一步分析miR-122靶标所富集的功能通路，细胞连接和细胞骨架重组是最富集的功能通路，这些发现进一步说明了细胞连接和细胞骨架重组是miR-122结合的主要的信号通路，而且是潜在的疾病驱动因子。
miR-122在很多动物中都是保守的，因此作者想研究一下其靶标是否同样是保守的。令人惊奇的是，miR-122在3’UTR的靶标，不管是经典还是非经典，其保守性要远远低于其他的top miRNA 靶标的保守性，在其他靶标区域也有类似的结果（Figure 2D）。文章接下来更加专注在人和小鼠的靶标保守性上。对top miRNA来讲，虽然有30%的靶标是保守的，但对于miR-122的经典和非经典的靶标，却只有16%和23%的保守率（Figure 2E）。按照保守性的不同将基因进行分类，并没有发现功能上的差异。总的来说，miR-122的靶标在任何小鼠之间显得更为不保守。
图2. miR-122结合转录组的功能特征分析。（A）带有边界柱形图的散点图展示了miR-122敲除前后，Ago在3’UTR 结合强度的变化和mRNA表达量变化之间的关系。红色点表示miR-122的经典靶标，蓝色表示非经典靶标，灰色表示top miRNA靶标。（B）展示了基因组不同区域上Ago结合强度的变化。（C）展示了基因的不同区域上，表达量的变化差异。（D）展示了miRNA靶标的保守性分析结果。（E）展示了人和小鼠之间，miR-122的靶标在3’UTR和CDS区域显得更加不保守。
3、人的肝脏组织和肝癌组织中miR-122的Ago结合特征
miR-122的表达量在人肝癌里是低表达的，根据研究获得的miR-122靶标物种特异的结果，作者想进一步研究miR-122的结合在人肝癌（HCC）中有怎样的特点。作者对9对病人的肝癌组织和癌旁组织进行了Ago CLIP-seq和数据分析。miR-122在癌症中的低表达确实是存在的。在3’UTR和CDS区域，经典和非经典的结合位点在肿瘤样品中结合强度都明显降低（Figure 3A）。而且我们还证实了癌症特异的miRNA miR-21在癌症样品中的富集性。miR-122和miR-21这种结合强度呈现相反的特征，在CDS、intron和5’UTR区域也得到了体现（Figure 3B）。而且作者发现Ago的结合强度和miR-122的表达量是非常相关的（Figure 3C）。进一步分析miR-122靶标在人和小鼠中的异同，所有的4771个靶标基因中，有965基因存在不同程度的重叠（Figure 3D）。说明miR-122的靶标在不同的物种中差异程度还是比较大的。
图3. miR-122的结合在肝癌病人中呈现降低的特征。（A）累计分布曲线展示了在3’UTR区域不同miRNA的结合强度的变化趋势。（B）盒形图展示了不同miRNA在癌症和癌旁组织中结合强度的变化。（C）相关性分析展示了CLIP结合强度变化和miR-122表达量之间的相关性。（D）miR-122靶标基因在人和小鼠中的重叠性分析结果。饼图展示了靶标基因在RNA-seq中的表达量变化。
4、肝癌病人中miR-122靶标表达量和病人存活率呈现相关性
为了进一步分析这965个共同的靶标基因在癌症致病性中的作用，作者下载了TCGA的肝癌数据，并对这965个基因进行了分析。分析其表达量，发现大部分基因的表达都有一定的上调（图 4A）。作者接下来将重点放在了这些上调靶标基因和癌症病人存活率之间的关系。有3个基因，在肝癌中高表达（图 4B），而且和miR-122的表达呈现负相关（图 4C）。而且和癌症病人的存活率有很大关系（图 4D）。以上这些结果说明了miR-122的靶标基因在肝癌组织中被激活表达了。
图4. miR-122靶标基因在肝癌中的高表达和存活率存在相关性。（A）heatmap图展示了965个miR-122靶标基因在TCGA肝癌数据中的高表达。（B）展示了三个基因在癌症病人中的高表达。（C）展示了这三个靶标基因的表达量和miR-122的表达量呈现负相关性。（D）展示了这三个基因显著影响病人的存活率。
5、miR-122通过抑制BCL9来调节b连环蛋白依赖的转录
作者进一步验证了这些和存活率相关的基因是miR-122的靶标。三个基因都含有miR-122的结合位点，以及Ago的结合证据。尤其是BCL9，和b连环蛋白转录相关的基因，在CDS区含有6个miR-122的结合位点（图 5A）。三个基因在miR-122敲除后，表达量均升高（图 5B）。回补了miR-122的模拟基因后，三个基因的表达量显著下降（图 5C）。
图5. miR-122三个靶标基因的表达量变化展示。（A）Ago-CLIP结合特征在这三个基因上的展示，黑色箭头表示miR-122的结合位点。（B）展示了三个基因在miR-122敲除前后表达量的变化。（C）柱状图展示了加入miR-122模拟基因后三个靶标基因的变化趋势。
使用荧光素酶标记系统，验证了miR-122在SLC52A2和STX6的3’UTR的结合（图 6A-B）。对BCL9进行验证，发现大部分结合位点都检测到了miR-122的抑制作用（图 6C）。
图6. 荧光素酶标记系统来验证这三个基因为miR-122的靶标。（A-B）荧光素酶标记系统验证了miR-122对SLC52A2和STX6的结合抑制作用。（C）荧光素酶标记系统验证了miR-122对BCL9的结合抑制作用。
为了验证miR-122对BCL9 CDS区域的结合，作者过表达了BCL9，并加入了miR-122模拟基因在H293T细胞中。BCL9的RNA和蛋白量都显著降低，而突变miR-122的结合位点后，这种降低的现象就消除了（图7A）。考虑到BCL9会调控b连环蛋白的表达，因此我们检测了b连环蛋白的表达量。发现加入miR-122之后，b连环蛋白的表达量在WT-BCL9和MUT-BCL9中均下降，但其蛋白水平只在WT-BCL9中有所下降（图 7B）。同时BCL9的敲除导致了b连环蛋白靶标蛋白的表达量下降（图 7C）。这些结果在Huh7.5细胞中同样得到了验证，miR-122和BCL9共同敲除后，基因的表达量显著下降（图7D）。同样的，在过表达BCL9后，我们观测到了细胞增殖现象的增强（图 7E-F）。这些现象说明了作为miR-122的一个保守的靶标，BCL9可能通过增殖作用来影响WNT介导的HCC增生。更广泛地讲，以上这些结果充分说明了CLIP技术在解析miRNA靶标网络图中的显著优势，而且相似的策略可以用在鉴定肝病起因的候选基因上。
图7. miR-122通过抑制BCL9来调节b连环蛋白依赖的转录过程。（A）miR-122对BCL9的抑制作用，但对BCL9蛋白的影响不是很大。（B）miR-122对b连环蛋白的抑制作用。（C）BCL9对b连环蛋白靶标蛋白的抑制作用。（D）不同的敲除对b连环蛋白靶标蛋白的作用影响。（E-F）展示了BCL9敲除或者过表达对细胞增殖的影响。
