为什么很多剪接研究，最后都会做 minigene？一个经典实验如何验证RNA剪接机制

在前几篇文章里，我们讨论了一个核心问题：

究竟是谁在决定一个基因“怎么剪”？

研究者通常会先通过转录组数据发现某个基因存在可变剪接，然后进一步寻找可能参与调控的 RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBP）。通过 motif 分析、CLIP-seq 或表达数据，往往可以锁定一批候选调控因子。

但当研究推进到这里时，一个关键问题仍然没有解决：

这些RBP，真的在直接调控这个剪接事件吗？

换句话说，我们需要进一步回答：

• 哪一段 RNA 序列在发挥作用？

• 某个 RBP 是否通过这段序列影响剪接？

• 某个突变是否会改变剪接模式？

在绝大多数剪接机制研究中，用来回答这些问题的经典实验工具就是：

minigene。

从概念上看，minigene其实是一个 人工构建的剪接报告系统。

研究者会从目标基因中截取一段关键区域，通常包括：

• 一个目标外显子

• 上下游部分内含子

• 邻近外显子

然后将这段 DNA 片段克隆到表达载体中，在细胞中表达。

当该载体在细胞中转录后，会像天然基因一样经历：

转录 → pre-mRNA → RNA剪接

研究者随后通过 RT-PCR 或测序，就可以观察这段 RNA 在细胞中的剪接结果。

因此，minigene的核心价值在于：

在可控条件下“重建一个剪接事件”。

在真实基因组中，剪接调控往往受到很多因素影响，例如：

• 染色质状态

• 转录速率

• RNA结构

• 多个RBP的协同作用

这些因素叠加在一起，很难直接判断 到底是哪一段序列在决定剪接选择。

而 minigene 可以将复杂系统简化，让研究者能够单独测试：

• 某段序列是否是剪接调控元件

• 某个突变是否改变剪接

• 某个RBP是否参与调控

这也是为什么在很多剪接机制研究论文中，minigene几乎是必做实验。

在一项关于口腔鳞状细胞癌（OSCC）的研究中，研究者发现 SLC37A4 基因存在异常的可变剪接事件，并进一步证明剪接因子 SRSF9 通过调控这一剪接过程促进肿瘤进展。

研究最初来自 转录组数据分析。研究者对口腔癌组织和正常组织进行了 RNA-seq 数据比较，在分析剪接事件时发现，SLC37A4 的 exon7 在肿瘤样本中频繁发生跳跃（exon skipping）。这一剪接改变会产生一个新的转录本亚型 SLC37A4-S。随后通过 RT-PCR 和 Sanger 测序，研究者在细胞系中验证了这一剪接形式的存在，并发现该剪接亚型在肿瘤组织中显著升高。

接下来，研究者进一步探究这一剪接事件的功能。通过 构建不同剪接亚型的表达载体并进行过表达实验，他们发现 SLC37A4-S 可以明显促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示这一剪接事件可能具有促癌作用。

既然这一剪接变化具有功能意义，下一个关键问题就是：是谁在调控 exon7 是否被剪掉？

研究者首先利用 RBP motif 数据库和序列分析工具，在 exon7 及其邻近内含子区域寻找潜在的 RNA 结合蛋白（RBP）结合位点。结果发现，该区域存在多个 SRSF9 的典型结合 motif。同时在临床样本中观察到 SRSF9 在口腔癌组织中显著高表达，并且其表达水平与 exon7 skipping 的比例呈正相关。这些证据提示 SRSF9 可能参与调控 SLC37A4 的剪接选择。

但相关性并不能证明因果关系。为了验证 SRSF9 是否直接调控这一剪接事件，研究者构建了 SLC37A4 exon7 的 minigene 剪接报告系统。

在这一实验中，研究者将 exon7 及其上下游内含子序列克隆到一个剪接报告载体中。该载体设计为 EGFP / RFP 双荧光报告系统：当 exon7 被跳过（exon skipping） 时，报告基因阅读框保持完整，细胞会产生明显的荧光信号；而当 exon7 被保留（exon inclusion） 时，阅读框被破坏，荧光信号明显降低。通过检测荧光强度或RT-PCR产物，就可以判断剪接模式的变化。

当研究者在细胞中 敲低 SRSF9 时，minigene 报告系统中的荧光信号明显下降。

进一步通过 RT-PCR 分析剪接产物发现，exon7 的保留比例显著增加，说明 SRSF9 的缺失会抑制 exon7 的跳跃。

为了进一步验证这一调控是否依赖于特定序列，研究者又构建了 突变型 minigene，将 预测的 SRSF9 结合位点进行点突变。结果显示，在这些结合位点被突变后，即使存在 SRSF9，exon7 的跳跃也明显减少。这说明 SRSF9 必须通过这些特定 RNA motif 才能调控该剪接事件。

通过这一系列实验，研究者最终证明：SRSF9 通过结合 SLC37A4 exon7 周围的 RNA 序列，促进 exon7 skipping，从而产生具有促癌作用的剪接亚型 SLC37A4-S。

这个案例很好地展示了 minigene 在剪接研究中的关键作用：当研究者已经发现一个异常剪接事件，并锁定潜在调控因子后，minigene 可以在细胞中重建这一剪接过程，通过序列突变或RBP操作，直接验证剪接调控机制。

也正因为如此，在许多 RNA 剪接研究论文中，我们几乎都会看到这样一条经典技术路径：

剪接事件发现 → 调控因子预测 → minigene 机制验证。

在论文中，minigene实验往往只占一两张图，但实际上，从设计到结果解析往往需要经历一整套实验流程。

一个典型的 minigene 验证实验通常包括几个关键步骤。

在 minigene 实验中，研究者将包含目标外显子及其上下游内含子序列的 DNA 片段克隆至表达载体中，构建 minigene 报告系统。该载体转染至细胞后，在细胞内转录产生 pre-mRNA，并经历 RNA 剪接。随后通过 RT-PCR 和凝胶电泳检测不同剪接产物，从而比较不同序列或突变对剪接模式的影响，为解析 RNA 剪接调控机制提供实验依据。

1. 剪接区域设计

首先需要确定需要验证的剪接区域。

一般来说，一个有效的 minigene 构建通常需要包含：

• 目标外显子

• 上下游部分内含子

• 邻近外显子

内含子区域过短可能丢失重要调控元件，而过长又会增加构建难度，因此设计阶段往往需要结合 基因结构信息与剪接位点预测 来确定合适范围。

2. minigene 载体构建

确定目标区域后，需要将该 DNA 片段克隆到剪接报告载体中。

在很多研究中，还会同时构建多个版本，例如：

• 野生型序列

• 突变型序列

• 删除某些调控元件的构建体

通过这些构建体之间的比较，可以解析不同序列对剪接的影响。

3. 细胞转染与表达

构建好的 minigene 载体需要转染到细胞中表达。

常见使用的细胞系包括：

• HEK293T

• HeLa

• 或与研究对象相关的细胞模型

如果研究者希望验证某个 RBP 的作用，还可以进行：

• RBP 过表达

• RBP knockdown

从而观察剪接结果是否发生改变。

4. 剪接结果检测

转染一定时间后，研究者会提取 RNA 并进行 RT-PCR 检测。

不同剪接形式通常会产生不同长度的 PCR 产物，因此可以通过：

• 凝胶电泳

• Sanger测序

• 或高通量测序

来确认剪接结果。

通过比较不同构建体之间的剪接比例变化，就可以判断：

• 某个序列是否影响剪接

• 某个突变是否改变剪接模式

• 某个RBP是否参与调控

客户提供：

感兴趣的待检基因，RNA-seq数据，iRIP/CLIP-seq数据

结果交付：

1）minigene构建的质粒

2）minigene序列设计示意图

3）实验报告：实验步骤，原始图片和数据，分析图片和表格，英文材料方法

案例介绍：

Chen F, Wang Q, Yu X, et al. MCPIP1-mediated NFIC alternative splicing inhibits proliferation of triple-negative breast cancer via cyclin D1-Rb-E2F1 axis[J]. Cell death & disease, 2021, 12(4): 1-16.

更多细节，欢迎咨询 027-87050299

官网：www.rxbio.cc

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