【最新！胃癌的单细胞测序研究】成纤维细胞在调节肿瘤微环境中的独特作用
技术简介
单细胞技术是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组和蛋白组等进行文库构建和高通量测序分析的新技术，它能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，2013年被Nature Method评选为年度技术。单细胞技术可同时平行分析成千上万个单细胞内数千个基因的表达变化，正在改变我们对细胞类型和功能的理解，将进一步助力在免疫学、神经生物学、胚胎发育和肿瘤及微环境等多个领域内生物学过程的探索和研究。
2015年以来，随着BD Rhapsody™、10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等单细胞测序技术的飞速发展，单细胞测序的成本大幅度降低，大规模样本的单细胞测序已成为可能。
技术方法
单细胞转录组测序(Single cell RNA sequencing）
是在单细胞水平对转录组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量转录组RNA进行扩增后进行高通量测序。
单细胞ATAC测序
染色质分为常染色质和异染色质，而常染色质处于松散的开放状态，允许反式作用结合顺式调控元件，进而调控基因表达。ATAC-seq利用tn5酶切割并捕获染色质开放区域，结合高通量测序和生信分析，可以系统研究全基因组范围内染色质开放区域，是表观调控的新方向。
单细胞免疫组库测序（ScTCR-seq、ScBCR-seq）
以T/B淋巴细胞为研究目标，通过多重PCR或5’RACE技术特异性扩增决定B淋巴细胞受体(BCR)或T淋巴细胞受体(TCR)多样性的互补决定区(CDR3区)，再结合高通量测序技术，全面评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的关系。通过单细胞测序平台进行免疫组库研究，可同时实现单细胞转录组和单细胞V(D)J测序，为免疫组学研究提供更具扩展性的平台。
空间转录组测序（STRNA-seq）
在多细胞生物中，单个细胞的基因表达严格按特定的时间和空间顺序发生，即基因表达具有时间特异性和空间特异性。细胞的空间位置就如同宇宙中行星的运行轨迹，对细胞、组织功能具有无可比拟的作用，同时基因表达的位置信息对于理解组织功能和病理变化具有重要的意义，空间转录组能实现高通量的基因表达分布检测。将空间转录组测序与单细胞测序整合，可以很好的揭示组织中细胞的空间组成，细胞类群的异质性分布以及基因在不同位置间的表达差异，从而获得完整的基因的时间和空间表达图谱。
产品优势
1.项目方案设计：根据客户要解决的科学问题，临床样本类型，预算等，协助设计和优化研究方案；
2.10X，BD双平台；
3.价格优势-混样建库，支持混样建库，降低实验预算；
4.单细胞悬液制备：对各种临床样本有丰富的解离经验（骨头，视网膜，血液，组织等），确保达到高质量的建库要求；
5.个性化数据挖掘支持：有多年的高通量数据挖掘积累，生物信息研究团队实力雄厚，可以协助客户更好地使用和转化海量的单细胞数据，支持数据解读，个性化分析以及数据亮点挖掘等服务。
6.延伸服务：基于单细胞测序结果，设计验证实验，支持后续课题以及基金申请等个性化服务。
2.10X，BD双平台；
3.价格优势-混样建库，支持混样建库，降低实验预算；
4.单细胞悬液制备：对各种临床样本有丰富的解离经验（骨头，视网膜，血液，组织等），确保达到高质量的建库要求；
5.个性化数据挖掘支持：有多年的高通量数据挖掘积累，生物信息研究团队实力雄厚，可以协助客户更好地使用和转化海量的单细胞数据，支持数据解读，个性化分析以及数据亮点挖掘等服务。
6.延伸服务：基于单细胞测序结果，设计验证实验，支持后续课题以及基金申请等个性化服务。
技术原理
单细胞BCR/TCR数据处理及分析
a)测序数据统计与评估
b)比对与注释：样本基本信息结果统计、样本contig注释信息结果统计、样本consensus注释信息结果统计
c)Clonotype分型
d)特征分析、CDR3特征分析、V/J基因特征分析、V-J paired特征分析
e)多样本分析：样本间Clonotypes比较、Overlapping Clonotype聚类分析、Overlapping Clonotype差异分析
b)比对与注释：样本基本信息结果统计、样本contig注释信息结果统计、样本consensus注释信息结果统计
c)Clonotype分型
d)特征分析、CDR3特征分析、V/J基因特征分析、V-J paired特征分析
e)多样本分析：样本间Clonotypes比较、Overlapping Clonotype聚类分析、Overlapping Clonotype差异分析
单细胞ATAC数据处理及分析
a)测序数据统计与评估
b)Peak Calling
c)聚类分析
d)TF-Motif分析
e)Marker基因展示
f)Peak分析与注释
g)差异Peak分析功能分析（GO Analysis）& 信号通路分析（Pathway Analysis）
h)差异可及性分析
b)Peak Calling
c)聚类分析
d)TF-Motif分析
e)Marker基因展示
f)Peak分析与注释
g)差异Peak分析功能分析（GO Analysis）& 信号通路分析（Pathway Analysis）
h)差异可及性分析
空间转录组测序样本准备流程
注意事项：
1.根据制备条件，客户可以送冰冻组织，也可以OCT包埋后再送样。样本处理和运输过程注意温度保持低温；
2.无法获得异戊烷的客户，可对新鲜组织直接进行OCT包埋；
3.RNA质检和染色质检结果均会发给客户确认没问题后，再进行后续实验。
1.根据制备条件，客户可以送冰冻组织，也可以OCT包埋后再送样。样本处理和运输过程注意温度保持低温；
2.无法获得异戊烷的客户，可对新鲜组织直接进行OCT包埋；
3.RNA质检和染色质检结果均会发给客户确认没问题后，再进行后续实验。
Visium空间转录组技术路线 （新鲜冰冻组织）
Visium空间转录组技术路线 (FFPE样本组织）
案例解析
案例文章1
研究方法
通过收集了12例死亡器官捐赠者的匹配组织/器官，分离免疫细胞，对分离获得T细胞和B细胞，进行单细胞RNA测序和配对VDJ测序，获得了约33万个免疫细胞的高质量单细胞测序数据。通过开发CellTypist，一个用于快速和精确的细胞类型注释工具，系统地进行组织间的免疫细胞类群注释。
主要结果
1. CellTypist:泛组织免疫细胞数据库和自动细胞类型注释工具
我们获得人体跨组织的免疫细胞类群的深度细胞图谱，并开发了一个自动注释免疫细胞类型和亚群的分析工具CellTypist。CellTypist能够实现更精细水平的细胞亚群注释，基于我们的跨组织的全转录组水平的单细胞测序数据，通过对祖细胞和树突状细胞等细胞类群进行精细注释，共注释了43种细胞亚群。CellTypist自动细胞类群注释将为进一步跨组织比较细胞类群提供基础。
2.单核吞噬细胞的组织局限性特征分析
对髓系细胞亚群的分析揭示了单核吞噬细胞的共有和组织特异性的特征，包括肺组织中的肺泡巨噬细胞、主要位于脾脏的铁循环巨噬细胞和迁移的树突状细胞亚群。
3.跨组织的B细胞亚群及免疫组库分析
我们的研究结果表明B细胞类群存在9种细胞亚群，且对naïve B细胞、记忆B细胞以及浆细胞的不同亚群特征的深入解析，促进了对B细胞认识。我们发现，与传统记忆B细胞克隆的广谱分布相比，组织特异的长寿命、静息浆细胞具有不同的克隆分布模式。
4. T细胞和先天淋巴细胞的单细胞转录组分析揭示了谱系和组织特异性亚群
对这些T细胞亚群组织分布的分析显示，尽管大多数CD4+T和ILC3细胞分布在淋巴结，并在脾脏也有一定的分布，但细胞毒性T和NK细胞主要分布在骨髓、脾脏和非淋巴组织(图4)。
5. TCR免疫组库分析揭示了组织内和跨组织的T细胞克隆扩展和分布模式
通过整合CellTypist自动注释、手动注释和V(D)J测序，解析了18种T细胞或先天细胞亚群的分布和潜在功能，促进了我们对脾脏、肝脏和肠道不同MAIT细胞及其抗原受体库分布的更深入理解，发现TRM_gut_CD8具有跨肠道区域的广泛的克隆共享，而TEM/EMRA_CD8和TRM/EM_CD8混合T细胞克隆具有广泛的组织分布。
结论和意义
利用来自12名死者供体匹配组织的近36万个单细胞转录组数据(其中约33万个为免疫细胞)，本研究展示了如何通过整合CellTypist自动注释、手动注释的聚类分析和抗原受体测序结果，解析人体中免疫细胞的组织特异性和功能相关性。本研究揭示了未被报道的髓系细胞和淋巴细胞的组织特异性免疫特征，并为未来的跨组织细胞类型分析提供了一个全面的框架平台。在未来的研究中，需要对人体组织常驻免疫进行进一步的研究，以确定重要协变量的影响，如潜在的危重疾病、供体年龄和性别，以及考虑免疫细胞激活状态，以清楚的获得人类生物学特征如何影响免疫功能。本研究通过对跨组织免疫细胞单细胞数据的深入解析，将治疗目的的细胞工程及其组织部位特异的输送、感染的组织特异性以及不同组织的疫苗接种方式等研究方向提供线索。
参考文献
Domínguez Conde, C. et al. Cross-tissue immune cell analysis reveals tissue-specific features in humans. Science 376, eabl5197, doi:10.1126/science.abl5197 (2022).
案例文章2
研究方法
通过收集3例原位肺腺癌(AIS)、3例微创腺癌(MIA)和3例侵袭性腺癌(IAC)6患者的活检组织，进行了单细胞转录组测序和空间转录组测序，对测序数据进行生物信息学分析，系统地比较不同组织间的细胞亚群组织及基因表达特征。
主要结果
1.LUAD侵袭中的不同肿瘤微环境细胞亚群鉴定及分析
为了探究不同肿瘤微环境（TME）细胞类型在LUAD侵袭过程中的变化，我们进一步研究了五种主要TME细胞类群，通过聚类分析将T/NK细胞和髓系细胞进行亚群分类，鉴定了8个T/NK细胞亚群，和10个髓系细胞亚群，表明增加Treg和减少单核细胞介导的肿瘤相关通路的激活促进了早期LUAD的侵袭。
2. 癌细胞与TME细胞的细胞间通讯促进IAC中TGF-β信号通路的激活
结果表明，肿瘤细胞间TGF-β信号通路以及TME细胞诱导的IAC中TGF-β信号的异常激活可能在晚期LUAD的侵袭中起关键作用。
3.Treg在癌组织中的空间分布介导了LUAD的侵袭
研究表明，TME细胞的空间分布及其密度变化在肿瘤的恶性表征中同样重要。为了明确LUAD癌细胞和微环境细胞空间结构，对6个样本(AIS: TD5、TD8; MIA:TD3, TD6; IAC: TD1, TD2)同时进行了单细胞转录组和空间转录组测序。这些数据表明，随着LUAD进展到IAC期，Treg大量浸润到癌区。值得注意的是，通过比较AIS和IAC样本的肿瘤血管区和正常区域，我们发现IAC的肿瘤血管区H&E的血管数量比正常血管区更明显(图3e, f)，VEGF表达水平也更高(图3g)。相反，AIS正常和癌性血管区血管密度和VEGF表达水平均无明显差异(图3eg)。这表明血管新生可能在LUAD的侵袭过程中起重要作用。综上所述，我们的结果表明，随着LUAD从癌前发展到IAC，Treg在癌区被募集，而NK细胞和肥大细胞浸润在该区域不存在。此外，我们发现癌血管异常在LUAD从AIS向IAC的侵袭过程中起着重要作用。
结论和意义
本研究在单细胞水平上鉴定了四种癌细胞亚群，UBE2C+癌细胞亚群参与了LUAD侵袭过程的早期和晚期，提示UBE2C可能是LUAD侵袭的启动因子。通过描绘LUAD的空间异质性，发现UBE2C+癌细胞主要分布在IAC和外周癌区，这代表了更活跃的肿瘤生物学行为，表明UBE2C可能作为LUAD瘤前病变和IAC病理鉴定的候选基因。同步的单细胞转录组和空间转录组的多组学方法绘制了侵袭性LUAD动态进化的单细胞基因表达和空间基因图谱，以确定DEGs、特定细胞亚群和细胞相互作用，这将有助于识别和开发侵袭性LUAD的个体化治疗策略。
参考文献
Zhu J, Fan Y, Xiong Y, Wang W, Chen J, Xia Y, Lei J, Gong L, Sun S, Jiang T: Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & molecular medicine 2022, 54(11):2060-2076.
