研究基因表达的不同方法：

批量与单细胞 RNA-seq

 

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什么是批量 RNA-seq？

Bulk RNA-seq 是一种基于下一代测序 （NGS） 的方法，用于测量细胞群中的整个转录组。这是一种全群体方法，这意味着它提供了整个样品的基因表达谱的读数，许多不同的细胞汇集在一起以贡献该谱。它也是一个平均读数，这意味着它提供了组成样品的所有细胞中单个基因的平均表达水平。

批量实验中的步骤：在批量 RNA-seq 工作流程中，生物样品被消化以提取 RNA。这可能是样品中的总 RNA，也可以采取措施富集 mRNA 或耗尽核糖体 RNA。RNA 转化为 cDNA，然后进行更多处理步骤以制备可测序的基因表达文库。测序和数据分析后，您可以查看整个组织样本的基因表达水平。

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什么是单细胞 RNA-seq？

单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种从样品中研究每个细胞的整个转录组基因表达谱的方法。

单细胞 RNA-seq 的样品制备：

scRNA-seq 测量来自单个细胞，而不是细胞池。首先需要从通过酶促或机械过程、细胞分选或其他细胞分离技术消化的整个样品中生成活的单细胞悬液。接下来是细胞计数和质量控制步骤，以确保样品具有适当浓度的活细胞，并且没有团块和细胞碎片。

如果需要还可以用抗体对样品进行染色，以标记蛋白质和其他生物分析物，或对感兴趣的细胞类型进行 FACS 富集。

不同的细胞捕获平台：

对于 10x Genomics scRNA-seq 工作流程（微流控原理），在分离 RNA 之前，将单个细胞分离到单独的微反应容器（凝胶乳中珠或 GEM）中。此分区步骤发生在加载到 Chromium X 系列仪器上的微流体芯片内的自动化、受控环境中。

随后，在 GEM 内，凝胶珠被溶解，释放出含有独特条形码的寡核苷酸。此外，细胞被裂解，允许捕获 RNA 并使用细胞特异性条形码进行条形码。这确保了每个细胞的分析物都可以追溯到其来源细胞。然后使用条形码产品创建测序文库，从而可以测量每个细胞整个转录组的基因表达。

对于 BD Rhapsody  scRNA-seq 工作流程（微孔板原理），将单个细胞与一个携带独特条形码的磁珠在微孔中进行一一配对。每个微孔就像一个独立的反应室，确保了后续分析的单细胞分辨率。配对成功后，系统会裂解细胞，释放出的mRNA随即与微孔中带条形码的磁珠进行杂交捕获。接下来，通过将新的核苷酸捕获到磁珠上，为后续的cDNA合成做准备。完成捕获后，所有磁珠被回收汇集。以此为基础，在磁珠上合成带有相同细胞来源条形码的cDNA。最后，通过高通量测序并对条形码信息进行解码，即可精确地构建出每个单细胞的基因表达谱，从而实现对细胞群体异质性的深入解析。

 

批量与单细胞 RNA-seq的应用

 
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批量RNA-seq
由于批量读数提供了样品平均基因表达谱的整体视图，因此该方法的一些关键应用包括：

● 差异基因表达分析：通过比较不同实验条件（包括疾病与健康、治疗与对照、发育阶段或时程实验）之间的批量基因表达谱，您可以识别在这些条件下上调或下调的不同基因。

○ 发现基于RNA的生物标志物和分子特征，用于疾病的诊断、预后或分层

○ 研究基因集（途径和网络）在各种生物条件下如何集体变化

● 组织或群体水平转录组学：批量数据还可以从整个组织、器官或批量分选的细胞群中获得全局表达谱。这种总体水平分析可用于：

○ 大型队列研究或生物样本库项目

○ 为新的或未充分研究的生物体或组织提供基线转录组学谱

○ 使用单细胞 RNA 测序参考图支持反卷积研究

● 识别和表征新转录本：批量数据可用于注释亚型、非编码 RNA、可变剪接事件和基因融合。

 
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单细胞RNA-seq
通过单细胞基因表达读数，我们可以解析异质样品中更多层次的生物学复杂性，包括梳理出稀有或低丰度的细胞类型和细胞状态，并揭示细胞功能和分化的潜在机制。

表征异质细胞群，包括新型细胞类型、细胞状态和稀有细胞类型

● 组织中存在哪些细胞类型或状态（例如，脑组织中的神经元与星形胶质细胞）？

● 不同细胞类型或状态的比例是多少？

● 相似细胞类型或亚群（例如，T 细胞的不同亚型）之间的基因表达差异是什么？

● 基因表达程序在所谓的同质细胞类型（例如，循环状态与静止状态、激活免疫细胞与静止免疫细胞）中如何变化？

● 是否有罕见的细胞类型或瞬态在生物学中起关键作用？

发现新的细胞标志物和调控途径

● 基因在单细胞水平上的共表达模式是什么？

● 敲除某些基因如何影响独特细胞群中的其他基因程序？

重建发展层次结构和血统关系

● 细胞异质性如何随时间演变（例如，在发育或疾病进展过程中）？

分析和患病组织、器官和系统

● 单个细胞如何对刺激或扰动做出反应，例如治疗或疾病状况？

● 某些细胞或细胞状态是疾病生物学或治疗耐药性的主要驱动因素吗？

 

批量与单细胞RNA-seq的优缺点

 
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批量RNA-seq
批量 RNA-seq 工作流程的优点是作为全转录组分析的低成本选择，重点是群体水平的见解。较低的测序深度要求进一步降低了成本。此外，对样品制备的要求更简单，数据复杂性和分辨率更低，使其成为更简单的工作流程和更直接的分析。

然而，这些优势伴随着分辨率和生物发现潜力方面的重大权衡。由于 bulk RNA-seq 提供了样品中所有细胞的基因表达的平均读数，因此它无法区分基因表达读数的细胞起源。这将掩盖一种或几种细胞类型是否是某个基因或独特转录本的主要生产者。

这也意味着批量读数无法揭示样品的细胞异质性，因此对于高度异质性组织来说不太理想。相比之下，单细胞测序可以揭示这种异质性，甚至可以带来稀有、低丰度的细胞类型，这些细胞类型可能会推动独特的基因表达谱。

 
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单细胞RNA-seq
单细胞 RNA-seq 具有强大的优势，可以以单个细胞的分辨率提供全转录组分析，从而以前所未有的方式推进生物学发现。

然而，单细胞工作流程需要在成本和复杂性之间进行权衡。与批量测量相比，单细胞 RNA-seq 通常与更高的成本相关。就复杂性而言，单细胞 RNA-seq 需要将样品解离成单细胞悬液和高细胞活力，这使得技术上更复杂的样品制备工作流程。此外，还需要复杂的分析来释放单细胞数据集的全部潜力。

但困难的事情往往是最有价值的。正如在它所实现的发现中看到的那样，单细胞分析可以为我们的研究更多突破性发现。

作者：Olivia Habern

推文来源：https://www.10xgenomics.com/blog/bulk-vs-single-cell-RNA-seq-experimental-differences-and-advantages-of-single-cell-resolution