看单细胞&全长转录组如何联手攻克胃癌腹膜转移难题

○ 分析公共单细胞RNA-seq数据库（GSE163558, GSE183904）。

○ 使用患者来源类器官（PDO）模型进行验证。

○ 免疫组化（IHC）分析包含102对癌与癌旁组织和20例腹膜转移灶的组织芯片。

○ Western Blot、免疫荧光、生存分析。

 关键结果:

○ 单细胞分析显示，与原发性胃癌相比，PTBP3在腹膜转移灶的肿瘤细胞中显著高表达（Fig. 1a-d）。

○ 转移来源的类器官（M-PDO）中PTBP3的mRNA和蛋白水平均高于原发来源的类器官（P-PDO）（Fig. 1f, h）。

○ 临床样本IHC证实，PTBP3在癌组织中的表达高于癌旁组织，在转移灶中的表达又显著高于原发灶（Fig. 1i, j）。

○ PTBP3高表达与患者总体生存期差显著相关，且与T分期和腹膜转移正相关（Fig. 1k）。

核心发现:

○ PTBP3是胃癌腹膜转移中一个关键的、与不良预后相关的过表达剪接因子，奠定了其作为研究靶点的临床相关性。

Fig.1

 ○ 在P-PDO中过表达PTBP3，在M-PDO中敲低PTBP3。

○ 在MKN45细胞（低表达PTBP3）中过表达PTBP3，在SNU-1细胞（高表达PTBP3）中敲除PTBP3。

○ 功能实验：3D Matrigel球体侵袭实验、EdU细胞增殖实验、Transwell实验。

 关键结果:

○ 在类器官和细胞系中，过表达PTBP3能促进球体直径增大 (Fig. 2c-e, i, j)、EdU阳性细胞数增多 (Fig. 2m, n)、迁移和侵袭能力增强(Fig. S6g, h)。

○ 反之，敲低PTBP3则抑制了这些恶性表型，表现为表现为球体直径减小 (Fig. 2f-h, k, l)、EdU阳性细胞数减少 (Fig. 2o, p)、迁移和侵袭能力减弱 (Fig. S6i, j)。

核心发现:

○ PTBP3在功能上直接促进了胃癌细胞的侵袭、增殖和迁移能力，这些是腹膜转移的关键步骤。

Fig.2

○ 对PTBP3过表达和对照的MKN45细胞进行 Oxford Nanopore全长转录组测序。

○ 生物信息学分析：筛选差异剪接事件、KEGG/GSEA通路富集分析。

○ 实验验证：琼脂糖凝胶电泳、Sanger测序、RT-PCR 检测COX11转录本。

○ 临床样本中分析PSI（外显子包含率） 与PTBP3表达的相关性。

关键结果:

○ 全长测序发现，PTBP3主要引起外显子跳跃(Fig. 3b)，并筛选出158个潜在靶基因(Data S2)。

○ 通路分析显示这些基因富集于代谢通路，特别是线粒体与TCA循环 (Fig. 3c, S7b, c)。

○ COX11被确定为关键下游靶点 (Fig. 3f)，PTBP3导致其外显子4跳跃，产生短转录本 (Fig. 3h, i)。

○ 在转移灶中，COX11的PSI值更低（即短转录本比例更高）(Fig. 3k)，且与PTBP3表达负相关 (Fig. 3j)，与患者不良预后相关(Fig. S9c)。

核心发现:

○ PTBP3通过介导COX11 pre-mRNA的外显子4跳跃，导致功能性短转录本（S-COX11）的增加，这可能是其促进转移的核心机制。

Fig.3

○ 设计合成2′-MOE修饰的反义寡核苷酸（ASO），特异性靶向S-COX11转录本。

○ 在PTBP3过表达或敲低的细胞和类器官中，进行ASO挽救实验。

○ 功能评估：3D球体形成实验、EdU实验、Transwell实验。

关键结果:

○ ASO能有效降解S-COX11 mRNA，而对长转录本影响较小 (Fig. S10b, c)。

○ 在PTBP3过表达的细胞中，ASO处理可以逆转由PTBP3带来的侵袭 (Fig. 4a, b)和增殖增强效应 (Fig. 4e, f)。

○ 在PTBP3敲低的细胞中，ASO能进一步抑制侵袭 (Fig. 4c, d) 和增殖 (Fig. 4g, h)。

核心发现:

○ PTBP3的功能在很大程度上依赖于S-COX11。靶向S-COX11的ASO药物能有效抑制肿瘤的恶性行为，证明了其作为治疗策略的可行性。

Fig.4

○ 构建体内腹膜转移模型：将荧光素酶标记的MKN45细胞（对照组/PTBP3过表达组）注射入裸鼠腹腔。

○ 实验组注射ASO药物。

○ 监测指标：活体成像监测肿瘤生长、肿瘤结节计数、腹水量、小鼠体重、组织学分析（H&E, IHC）。

关键结果:

○ PTBP3过表达组小鼠的肿瘤负荷 (Fig. 5b, c)、腹水 (Fig. 5f)、腹膜结节数量 (Fig. 5d, e) 均显著增加。

○ ASO治疗显著抑制了PTBP3过表达所导致的肿瘤生长 (Fig. 5b, c) 和转移 (Fig. 5d-f)。

○ IHC和RT-PCR证实，ASO处理降低了肿瘤组织中S-COX11的水平(Fig. 5j, k)。

核心发现:

○ PTBP3通过增加S-COX11促进胃癌腹膜转移，而靶向S-COX11的ASO在体内具有显著的治疗效果。

Fig.5

○ 使用铜离子荧光探针检测线粒体内铜浓度。

○ 联合使用铜离子载体Elesclomol（Eles）和CuCl₂。

○ 透射电镜观察线粒体形态，MitoTracker 标记线粒体。

○ 免疫荧光和Western Blot 检测铜死亡关键指标：DLAT蛋白的寡聚化和脂酰化水平。

关键结果:

○ PTBP3过表达导致线粒体铜水平略有下降，而ASO处理能显著提升线粒体铜浓度，尤其在Eles/CuCl₂存在下效果更显著 (Fig. 6d)。

○ ASO联合Eles/CuCl₂处理导致线粒体空泡化、功能受损 (Fig. 6f, g)。

○ ASO联合Eles/CuCl₂处理诱导了DLAT的显著寡聚化 (Fig. 6h, i)，这是铜死亡的直接证据。该过程依赖于FDX1(Fig. 6i, S12b)。

核心发现:

○ 靶向S-COX11的ASO通过破坏由PTBP3异常剪接建立的铜稳态，使肿瘤细胞对铜死亡敏感。 当与铜离子载体联用时，能协同诱导强烈的铜死亡。

Fig.6

○ 建立患者来源类器官异种移植（PDOX）模型，模拟人体内肿瘤微环境。

○ 设置四组治疗：对照组、ASO单药组、Eles/CuCl₂组、ASO+Eles/CuCl₂联合组。

○ 评估：肿瘤体积/重量、IHC（Ki67, PTBP3, 脂酰化蛋白）、免疫荧光（TOM20）、组织铜染色。

关键结果:

○ 联合治疗组显示出最强的肿瘤抑制效果 (Fig. 7b-d)。

○ IHC显示联合治疗组细胞增殖（Ki67）显著降低 (Fig. 7e, f)，脂酰化DLAT蛋白水平下降（表明其发生寡聚而被消耗）(Fig. 7e, h, S13b)。

○ 免疫荧光显示联合治疗组线粒体膜蛋白TOM20信号减弱，表明线粒体损伤 (Fig. 7e, i)。

○ 组织铜染色显示联合治疗组铜离子积累最明显(Fig. 7e)。

核心发现:

○ 在高度模拟临床的PDOX模型中，ASO联合铜离子载体能够通过诱导铜死亡，有效抑制胃癌腹膜转移瘤的生长，为临床转化提供了强有力的 preclinical 证据。

Fig.7

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