类器官是当下医学非常重要的研究领域，多能诱导干细胞（IPSC）是培养类器官非常重要的原材料，而针对IPSC的机制研究目前还有很多不明确的地方，本文我们与浙大王英杰教授合作探究了转录因子OCT4作为RNA结合蛋白对AKT直接翻译调控机制，让我们加深了OCT4对细胞重编程机制的新认知。
1️⃣ 突破发现：
经典转录因子OCT4竟能“兼职”RNA结合蛋白（RBP），通过结合mRNA的5′-UTR，驱动AKT等关键基因的翻译，成为干细胞应对缺氧/氧化应激的“生存开关”！
2️⃣ 技术融合：
✔ CLIP-seq精准捕获OCT4全基因组RNA互作图谱，锁定GC富集motif。
✔ RNA-seq + RNC-seq双剑合璧，解析低氧应激下翻译效率的动态变化。
✔ HKINT单等位基因编辑，首次实现5′-UTR结构破坏与功能验证的无缝衔接。
3️⃣ 临床启示：
为干细胞治疗中的应激损伤防护、癌干细胞靶向干预提供全新视角。
原文概览
英文标题：OCT4 translationally promotes AKT signaling as an RNA-binding protein in stressed pluripotent stem cells
中文标题：OCT4 作为应激多能干细胞中的 RNA 结合蛋白翻译促进 AKT 信号传导
期刊：Stem Cell Research & Therapy
影响因子IF：7.1
发表时间：2025.2.23
DOI： 10.1186/s13287-025-04229-1
瑞兴生物提供技术支持：
国自然热点 | RNA结合蛋白研究方法（四）_eCLIP-seq
✔ CLIP-seq：高分辨率绘制OCT4-RNA相互作用网络，锁定AKT1等靶标mRNA的精确结合位点。
✔ 生信分析：助力复杂机制的深度解析。
技术路线
主要结果
01 OCT4 通过转录后机制正向调节 AKT1 蛋白水平
OCT4 对 AKT1 转录和翻译的差异调节：研究团队前期发现 OCT4 在人胚胎癌细胞系（hECC）中能结合 AKT1 启动子抑制其转录，RNA 干扰敲低 OCT4 后，AKT1 mRNA 水平大幅上升，但蛋白水平却略有下降 。为进一步确认，研究人员使用针对 POU5F1（OCT4）基因的三对 siRNAs，在 hECC 细胞系 NCCIT、hESC 细胞系 H1 和 H9 中进行 OCT4 敲低实验。结果显示，OCT4 mRNA 和蛋白水平显著降低，同时 AKT1 mRNA 水平在三种细胞系中均显著上调，而 AKT1 蛋白水平则出现不同变化，有的细胞系中略上调，有的略下调，这取决于 OCT4 沉默的时长和效率。
转录抑制下 AKT1 蛋白水平的维持机制：用转录抑制剂放线菌素 D（Actinomycin D，ACTD）处理 H9 和 H1 细胞，AKT1 mRNA 水平在 48 小时内下降 50%-90%，但蛋白水平在该时间段内保持稳定。鉴于 AKT1 蛋白半衰期在 24-36 小时，这表明在转录受抑制时，AKT1 可能通过增强翻译来补偿其降解，说明 OCT4 对 AKT1 表达的转录和转录后 / 翻译调控之间存在明显差异。
OCT4 在细胞质中的定位：由于 OCT4 作为转录因子主要在细胞核发挥作用，而转录后 / 翻译过程多发生在细胞质，因此研究人员进行亚细胞分级分离实验。结果显示，在 H1 细胞的细胞质提取物中检测到 OCT4，其含量约占总 OCT4 蛋白的 10%，这表明部分 OCT4 存在于细胞质中，为其在细胞质中参与 AKT1 转录后调控提供了可能。
02 通过 HITS-CLIP 在体内全基因组破译 OCT4-RNA 相互作用组
OCT4 与 RNA 广泛结合且偏好 5′-UTR：研究发现 OCT4 能与众多 RNA 靶标结合，在转录组范围内展现出调控 RNA 代谢的活性。其结合标签广泛分布于 5′-UTR、编码序列（CDS）、内含子、3′-UTR 等多个基因区域，但在 5′-UTR、3′-UTR 和 CDS 区域显著富集，尤其对 5′-UTR 有明显的结合偏好。这一偏好通过其在转录起始位点后及起始密码子处的结合特征得以证实，暗示 OCT4 可能参与翻译起始过程。
鉴定 OCT4 结合位点和相关基因：研究共鉴定出大量 OCT4 的结合位点和与之相关的基因。两个独立实验的重复样本分别识别出 25,120 和 29,211 个结合位点，对应 9654 和 10,740 个基因，这些结合位点的平均宽度约为 200bp。同时，两个实验重复样本间检测到 1,486 个重叠基因，其重叠峰在 5′-UTR、CDS 和 3′-UTR 区域也呈现出显著富集的特征。
明确 OCT4 结合基序及其分布：通过对 OCT4 结合位点的分析，发现富含 GC 的序列在其结合基序中占据主导地位，其中 5′-CTGCCG-3′和 5′-GAGCCG-3′这两个六聚体在 5′-UTR 区域高度富集，并且在翻译起始位点附近的富集程度尤为明显。这进一步为 OCT4 在 5′-UTR 调控和翻译起始过程中的重要作用提供了证据支持。
03 OCT4 与多个 PI3K/AKT 通路基因的 RNA 结合
OCT4 在相关生理过程中的潜在作用：通过基因本体（GO）分析发现，OCT4 的结合靶点在 RNA 代谢、翻译、多种刺激及应激反应等生理过程中显著富集，暗示其在蛋白质磷酸化、细胞凋亡信号通路和干细胞维持等方面有重要调控作用。此外，OCT4 结合的 RNA 所对应的基因具有 DNA 结合、RNA 结合和激酶结合等多种功能，且分布于细胞的多个区室。
OCT4 与 PI3K/AKT 通路基因的关联：KEGG 通路分析显示，OCT4 结合的 RNA 聚集在多个信号通路，其中包括 PI3K/Akt 信号通路。研究证实，OCT4 能与多个 PI3K/AKT 通路基因的转录本结合，如 PIK3CD、PIK3R2、PDPK1、AKT1 等。并且，OCT4 与部分 PI3K/AKT 通路基因的正义转录本在 5′-UTR 附近结合，提示其可能参与这些基因的翻译起始调控。
结合的验证：为进一步确认，研究人员利用 RIP-qPCR 技术，以 IgG 和 FLAG M2 beads 作为阴性对照，对 HITS-CLIP 实验中鉴定出的 OCT4 的 10 个 mRNA 靶点（包括 AKT1、PIK3R2 等）进行验证，结果证实了 OCT4 蛋白与这些 mRNA 靶点的结合，表明 OCT4 可能通过直接结合 PI3K/AKT 通路基因的 5′-UTR 来调控其翻译过程。
04 OCT4 与调节不依赖帽和/或帽依赖性但不依赖 EIF4F 的翻译起始的蛋白质相互作用
研究方法：为探究 OCT4 在翻译调控中的潜在作用，研究人员对 TAP-OCT4 H1 细胞进行处理，用抗 FLAG-M2 抗体免疫沉淀内源性 TAP-OCT4 蛋白，再经洗涤、洗脱后，通过质谱鉴定与 OCT4 结合的蛋白质。同时，使用预期结合亲和力和特异性较低的 OCT4 抗体（SC – 5279）进行独立验证。
相互作用蛋白的鉴定与分析：经质谱分析，在抗 FLAG IP 复合物中鉴定出 187 个肽段（142 个有效肽段、75 种蛋白质），在抗 OCT4 IP 复合物中鉴定出 1117 个肽段（905 个有效肽段、412 种蛋白质）。对比发现，有 28 种推定的 OCT4 结合蛋白在两次 IP 实验中均被鉴定出来，排除在阴性对照中出现的 ANXA2 蛋白后，确定了 27 种真正的 OCT4 相互作用蛋白。
相互作用蛋白的功能分类：对这些相互作用蛋白进行 GO 注释分析，结果显示它们主要分布在细胞核、细胞质和细胞膜等细胞组分中；在分子功能上，多与翻译因子结合、RNA 结合和蛋白结合相关；在生物学过程方面，主要涉及细胞 – 细胞黏附、蛋白质折叠、翻译延伸和应激反应等。KEGG 通路分析表明，相关基因主要聚集在蛋白质在内质网的加工、RNA 转运、RNA 降解和吞噬体等通路。
与翻译起始的关联：通过 STRING 进行蛋白质组网络分析，发现多个 OCT4 相互作用蛋白与翻译、转录、应激反应和转运等 4 个功能组相关，其中包含多个参与翻译起始的蛋白（如 40S 核糖体组分和 eIF 亚基）。尤其值得注意的是，在 27 种 OCT4 相互作用蛋白中，发现了经典的 IRES 反式作用因子（ITAF）HNRNPA1 和 EIF3 的重要组分 EIF3G。鉴于已有研究表明 EIF3 相关亚基可参与不依赖帽和 / 或帽依赖性但不依赖 EIF4F 的翻译起始过程，这意味着 OCT4 可能参与此类翻译起始过程，调节相关基因的翻译。
05 PI3K/AKT 通路基因 mRNA 通常与 OCT4 和 OCT4 相互作用的 RBP 结合
OCT4 与关键 RBP 的相互作用验证：在确定 OCT4 能与调节特定翻译起始的蛋白质相互作用后，研究人员对其中两个关键的 OCT4 相互作用蛋白 EIF3G 和 HNRNPA1 进行验证。通过 Western blotting 实验，利用 FLAG M2 抗体免疫沉淀 TAP-OCT4 H1 细胞中的 TAP（3×FLAG）-OCT4 和 H1 细胞中的非标记 OCT4，结果显示 TAP-OCT4 成功从 TAP-OCT4 H1 细胞中免疫沉淀出来，且 EIF3G 和 HNRNPA1 蛋白在 TAP-OCT4 H1 细胞中的共免疫沉淀量远多于 H1 细胞，证实了它们与 OCT4 的相互作用。
共同结合 mRNA 的分析：研究人员进一步对比 HNRNPA1、EIF3G 和 OCT4 的 RNA 相互作用组，发现有 34 种 mRNA 被这三种 RBP 共同结合，总计 634 种 mRNA 能同时被 OCT4 与 HNRNPA1 和 / 或 EIF3G 结合。在这些 mRNA 对应的基因中，至少有 13 个属于 PI3K/AKT 通路基因。
结合位点的特征：通过对 PI3K/AKT 通路基因 mRNA 上 OCT4、HNRNPA1 和 EIF3G 的结合峰进行分析，发现存在部分重叠或相邻的峰，表明这三种蛋白可能共同作用，作为不依赖帽和 / 或帽依赖性但不依赖 EIF4F 的翻译起始复合物的一部分，调控 PI3K/AKT 通路基因的翻译水平。
06 OCT4 调节缺氧 hESC 中 PI3K/AKT 通路基因的翻译比例
实验设置：研究人员将转染了对照 siRNA（siNC）或 OCT4 siRNA（siOCT4）的 hESC，分别置于常氧（20% O₂ ）和缺氧（1% O₂ ）环境中培养，之后分别进行核糖体新生链复合物结合 RNA 测序（RNC-seq）和 mRNA 测序（RNA-seq）。
基因转录和翻译水平的变化：通过对测序数据的分析，研究发现缺氧条件下敲低 OCT4 时，在转录水平上，有 6283 个基因表达下调，2727 个基因表达上调；在翻译水平上，843 个基因的翻译减少，567 个基因的翻译增加。
PI3K/AKT 通路基因翻译比例受 OCT4 调节：计算翻译比例（TR），即翻译的 mRNA 与总转录的 mRNA 的比值。结果显示，在 siOCT4 处理的缺氧 hESC 中，60% 的 PI3K/AKT 通路基因 TR 下降，而在所有检测基因中，只有 22% 的基因 TR 下降。这表明在应对缺氧应激时，OCT4 对于维持或促进 PI3K/AKT 通路基因的翻译至关重要。
相关生物过程和信号通路分析：对基因进行 GO 和 KEGG 分析，结果表明，在缺氧且敲低 OCT4 的情况下，TR 下调的基因显著富集在翻译起始、应激反应、凋亡和自噬等生物过程，以及 PI3K/AKT、mTOR、胰岛素等信号通路；TR 上调的基因则与细胞分裂、DNA 修复相关，涉及基础转录因子、泛素介导的蛋白水解、细胞周期和 PI3K/AKT 等信号通路。在 PI3K/AKT 信号通路中，像 AKT1、PIK3R2 等关键节点基因的 TR 下调，而 AKT3、PIK3R1 等基因的 TR 上调。这进一步揭示了 OCT4 对 PI3K/AKT 通路基因翻译的复杂调控机制。
07 OCT4 促进 IRES 介导的 AKT1 翻译起始
AKT1 翻译起始机制的推测：已知 OCT4 能结合 AKT1 mRNA 的 5′-UTR，且前期研究提示 AKT1 可能含有潜在 IRES 序列，其翻译起始或许通过 IRES 结构以不依赖帽的方式进行。研究人员利用 Mfold 网络服务器模拟 AKT1v1 和 v3 的 5′-UTR 二级结构，发现二者均呈现茎环结构，为 IRES 介导的翻译起始提供了结构基础。
双荧光素酶报告系统验证：研究人员运用双荧光素酶报告系统，评估 AKT1v1 和 v3 的 5′-UTR 介导翻译起始的能力。实验结果显示，AKT1v3 的 5′-UTR 能够促进荧光素酶报告基因 FLUC 的翻译，而 AKT1v1 的 5′-UTR 则无此作用，表明 OCT4 结合的 AKT1v3 5′-UTR 上的 IRES 样结构很可能介导了翻译起始过程。
缺氧条件下的验证：在缺氧环境中，细胞的翻译模式会从依赖帽的方式转变为 IRES 介导的途径。研究人员用 4E1RCat（一种能阻断依赖帽的 EIF4F 翻译的抑制剂）处理转染了 OCT4 siRNA 或对照 siRNA 的 hESCs，并将其置于 1% O₂的缺氧环境中。结果发现，在对照 siRNA 转染的细胞中，4E1RCat 处理后 AKT 蛋白水平显著增加，这表明当 EIF4F 依赖的翻译途径被阻断时，IRES 途径介导的 AKT 蛋白合成被激活；而在 OCT4 siRNA 转染的细胞中，这种由 4E1RCat 诱导的 AKT1 蛋白水平的反弹增加完全消失。这进一步证明了 OCT4 在缺氧条件下，对 IRES 介导的 AKT1 翻译起着关键作用。
提出工作模型：综合上述实验结果，研究人员提出了 OCT4 作为 RNA 结合蛋白（RBP）和可能的 IRES 反式作用因子（ITAF）调节 IRES 介导的翻译起始的工作模型。在正常情况下，OCT4 作为转录因子抑制 AKT1 的转录；在应激条件（如缺氧）下，OCT4 结合在 AKT1 5′-UTR 的 IRES 样结构上，与其他 ITAFs 和 EIF3 共同作用，招募 40S 核糖体亚基，启动翻译过程，从而快速增加 AKT1 蛋白水平，促进多能干细胞（PSC）的存活和自我更新。
08 OCT4 促进的 AKT1 翻译抵消缺氧和氧化应激并调节谱系规格
实验方法：运用 CRISPR/Cas9 系统，在野生型 H9 细胞的 AKT1 基因外显子 2 中敲入 TAP 标签，构建具有野生型 AKT1 等位基因和 TAP – AKT1 敲入等位基因的杂合克隆（如 A1101、A1103）。该方法（HKINT）可改变 AKT1 mRNA 5′-UTR 的二级结构，减少 OCT4 与 AKT1 mRNA 的结合，用于研究其对 AKT1 翻译及相关细胞功能的影响。
对 AKT1 翻译的影响：实验结果显示，在杂合 TAP – AKT1 克隆中，TAP – AKT1 蛋白水平显著低于野生型 AKT1，而其 mRNA 水平却高于野生型。在缺氧条件下，TAP – AKT1/WT AKT1 的比值持续下降，表明 TAP – AKT1 mRNA 的翻译起始受抑制，这是由于其 5′-UTR 结构改变，降低了 OCT4 的结合，进而影响翻译。
对细胞应激反应的影响：在氧化应激条件下（用 1000 μM H₂O₂处理），与野生型 H9 细胞相比，杂合 TAP – AKT1 H9 克隆中晚期凋亡细胞比例显著增加，表明这些克隆对氧化应激更为敏感，说明 OCT4 促进的 AKT1 翻译在抵抗氧化应激、维持细胞存活方面发挥重要作用。
对细胞谱系分化的影响：将细胞置于不同谱系诱导培养基中培养，发现杂合 TAP – AKT1 H9 克隆更倾向于向 ectoderm（外胚层）分化，在一定程度上也向 endoderm（内胚层）分化，但向 mesoderm（中胚层）分化的能力未发生明显改变。这表明 OCT4 促进的 AKT1 翻译对细胞谱系分化具有调节作用，抑制该翻译会影响细胞分化方向 。
研究总结
本文研究发现，OCT4在人类多能干细胞（PSCs）中作为RNA结合蛋白（RBP），通过结合AKT1等PI3K/AKT通路基因mRNA的5′-UTR GC富集元件，在缺氧等应激条件下通过IRES介导的非帽依赖性途径促进其翻译起始，维持AKT蛋白水平以增强PSCs抗氧化应激能力、抑制凋亡，并调控其向三胚层的分化方向（如优先向外胚层和内胚层分化）；特异性破坏OCT4与AKT1 mRNA的相互作用会显著降低AKT1翻译，加剧PSCs对氧化应激的敏感性并影响分化平衡。
参考文献
Chen W, Chen X, Chen C, et al. OCT4 translationally promotes AKT signaling as an RNA-binding protein in stressed pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):84. Published 2025 Feb 23. doi:10.1186/s13287-025-04229-1