在读基因测序报告、科研文章或分析结果时，是否常常被各种术语淹没：
Reads、Q30、Coverage、Peak、Motif……
看得懂字，却看不懂“话”？

本文将带你系统掌握高通量测序（NGS）中的关键入门术语~

 

测序技术发展

从 Sanger 到 NGS 再到长读长 

 
第一代测序（桑格测序）是测序技术的奠基者，采用末端终止法，一次反应获得一条长约1000bp的高精度序列，至今仍是验证测序结果的“金标准”，但其低通量、高成本的特点限制了大规模应用。

第二代测序（NGS）以Illumina和华大基因为代表，通过边合成边测序技术实现大规模并行测序，将通量提升数个数量级的同时大幅降低成本，成为当今基因组学研究与临床检测的绝对主流。其核心优势在于高通量、高准确性，但读长较短。

第三代测序以PacBio和Oxford Nanopore为代表，实现了单分子实时测序，无需PCR扩增。其革命性优势在于超长读长，能够跨越复杂基因组区域，直接检测表观修饰，在基因组完整组装、结构变异解析等领域具有不可替代的价值。

 

测序数据基础

什么是 Reads？PE？

 
1
Reads（读长）
在高通量测序中，Reads 是指测序仪读取到的DNA或RNA片段序列。不同测序平台产生的Reads长度差异显著：

● 二代短读长平台：通常为50~300 bp，适合高精度、高通量的项目。

● 三代长读长平台：可长达 10 kb 以上 ，适合结构变异、全长转录本分析等。

 
2
PE（双端测序） vs. SE（单端测序）
● PE：对DNA片段两端同时测序，提供更多定位信息，适用于基因组组装、变异检测等。

● SE：仅测一端，成本低，适用于小RNA、miRNA等短序列项目。

选择建议：若预算允许，优先选择PE测序，数据利用率与可靠性更高。

 

样本 → 文库 → 上机

建库是数据质量的根本 

 
1
Library（文库）
文库是经过片段化、末端修复、接头连接等步骤处理后的核酸样本，是测序的“原料”。其质量直接决定数据可靠性。常见的建库流程包括：

● DNA建库流程（以全基因组测序为例）

DNA样本 → 片段化 → 末端修复 & 3’端加”A” → 连接接头 → PCR富集 → 文库质控 → 上机测序

● RNA建库流程（以mRNA转录组测序为例）

Total RNA → mRNA富集（或rRNA去除）→ 片段化 → 反转录为cDNA → 双链cDNA合成 → 末端修复 & 3’端加”A” → 连接接头 → PCR富集 → 文库质控 → 上机测序

 
2
Insert Size（插入片段大小）
指插入到测序载体中的核酸片段长度。不同项目对插入片段有不同要求：

● WES全基因组测序：300–500 bp

● RNA-seq转录组测序：200–300 bp

合适的插入片段能提升测序效率与数据均匀性。

 
3
Index（索引）
Index是嵌在接头中的短序列，用于在混合测序中区分不同样本。常见类型包括：

● 单端Index：一个样本一个标签

● 双端Index：两端各一个标签，识别更精准

Index技术是实现“多样本混测”的核心，极大降低了单位样本成本。

单端index文库结构

双端index文库结构

 

数据分析的核心指标  

 
 
1
Coverage（覆盖度）
指测序数据覆盖目标区域的程度，常用“X倍数”表示。例如：

● 30X 覆盖度：表示平均每个碱基被测序30次。

● 高覆盖度有助于发现低频突变，提高检测灵敏度。

  
2
Depth（测序深度）
指目标区域上总Reads数与区域长度的比值。深度越高，数据越可靠，尤其适用于：

● 肿瘤基因突变检测

● 稀有变异挖掘

 
3
Quality Score（质量分数）
使用Phred分数评估每个碱基的测序准确性：

● Q30：错误率为1/1000， 99.9% 准确

● Q20：错误率为1/100， 99% 准确

常以“≥85% Reads 达到 Q30”作为高质量数据标准。

 
4
比对
参考基因组：作为比对基准的高质量基因组序列。

比对率：成功比对到参考基因组的Reads比例。低的比对率可能提示样本污染或参考基因组选择不当。

 

 

基因组变异

读懂 SNP、SNV、InDel、CNV、SV

 
1
SNP 与 SNV
● SNV：指基因组上一个单核苷酸位置发生的变异（例如，一个A变成了T）。它是一个广义术语，涵盖了所有此类单点变化。

● SNP：特指那些在群体中发生频率大于1% 的SNV。通常指代在人群里常见的、遗传下来的多态性位点。

简单理解：所有的SNP都是SNV，但并非所有的SNV都是SNP。SNP更强调“群体普遍性”，而SNV是一个更中性的技术术语。在肿瘤研究中，体细胞突变常称为SNV；在群体遗传中，则常用SNP。

 
2
InDel
指在基因组特定位置发生的、长度相对较小的插入或缺失事件，通常指涉及几十个碱基对以内的变化。

● 关键影响：在编码区的InDel如果不是3的倍数，会导致移码突变，从而可能造成蛋白质功能的严重破坏。

 
3
CNV 与 SV
这两种都属于基因组上大规模的变异。

● CNV：指基因组上一段DNA序列（通常>1kb）的拷贝数目相较于参考基因组发生了变化，包括缺失和重复/扩增。

○ 应用：是癌症基因组（如致癌基因的扩增）和遗传病研究中的重要标志物。

● SV：指基因组发生的大尺度结构改变，通常涉及>1kb的DNA片段。

○ 主要类型：

ⅰ. 缺失 / 重复（与CNV有重叠）

ⅱ. 倒位：一段序列被反向插入。

ⅲ. 易位：两段来自不同染色体或同一染色体不同位置的序列发生交换。

○ 应用：是许多遗传性疾病和癌症的重要驱动因素。

简单理解：CNV主要关心“数量” （一段DNA有几份拷贝）；SV主要关心“结构”与“位置” （DNA片段是否被重排了）。易位和倒位属于SV，但不属于CNV；大的缺失/重复则既是SV也是CNV。

 

转录组重要概念

转录本与基因

 
1
什么是转录本？
转录本 是指一个基因通过转录过程所生成的所有RNA产物的统称。

● 过程：DNA（基因）→ 通过RNA聚合酶转录 → 初级RNA → 经过加工 → 成熟的RNA（即转录本）。

● 主要类型：对于编码蛋白质的基因，其最主要的转录本就是信使RNA。因此，在转录组测序中，我们通常所说的“转录本”即指成熟的mRNA。

 
2
为什么一个基因可以有多个转录本？
这是真核生物基因表达复杂性和多样性的关键机制，称为可变剪接。你可以将一个基因想象成一个“配方”，而多个转录本就是根据这个配方做出的“不同菜式”。

主要原因和机制如下：

1. 可变剪接（核心机制）：

○ 基因由外显子和内含子构成。转录后，初级RNA需要剪接，即“切除”内含子，“拼接”外显子。

○ 可变剪接允许细胞在不同的发育阶段、组织类型或环境信号下，选择性地将不同的外显子组合在一起，从而从一个基因产生多个外显子组成不同的mRNA。

2. 可变转录起始位点：

○ 基因可能有多个“启动开关”。选择不同的转录起始位点，会生成具有不同第一个外显子的mRNA。

3. 可变多聚腺苷酸化位点：

○ mRNA的3‘端需要添加一串“A”（多聚腺苷酸尾）。选择不同的加尾位点，会生成具有不同长度3’端非翻译区甚至不同末端外显子的mRNA。

 
3
多个转录本的意义是什么？
● 功能多样化：一个基因产生的不同转录本，可能被翻译成结构、功能或定位不同的蛋白质亚型。一个基因因此可以执行多种功能。

● 精细调控：有些转录本可能包含影响mRNA稳定性、翻译效率或亚细胞定位的序列，实现对基因表达的精细调控。

● 适应复杂生命活动：这是高等生物用有限的基因数量（人类约2万个）产生极其复杂的蛋白质组和生命现象的核心策略。

 

表观组和转录因子研究

怎么看信号图

 
1
Peak（峰值区域）
Peak图本质上是展示测序读数在基因组某个特定区域富集情况的信号轨迹图。

1. 坐标轴：

○ X轴：基因组位置，通常会标注基因、启动子等关键区域。

○ Y轴：测序读数的富集强度（或信号值）。

 

2. 图中的“山峰”：

○ 峰的存在：有“山峰”的区域就是潜在的蛋白质结合或开放染色质区域。

○ 峰的高度：峰越高（Y轴值越大），代表该位点的结合强度越强或染色质可及性越高，通常也意味着该位点越重要。

○ 峰的宽度：峰越宽，代表结合的基因组区域越宽。

3. 对比样本：

○ 实验组：通常是有色的轨迹（如红色、蓝色），你会在目标区域看到明显的“山峰”。

○ Input/对照组：通常是灰色或黑色的轨迹，它代表背景信号，应该是平坦或无规则的。只有当实验组的峰显著高于Input对照组时，这个峰才是可信的。

一句话解读：寻找那些在实验组中高高耸起、而在对照组中平坦如初的“山峰”，它们就是你的目标功能区域。

 
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Motif（保守基序）
Motif图是对Peak区域中发现的保守DNA序列模式的直观展示，通常以序列标识图的形式呈现。

1. 每个字母的“高度”：

○ 在序列的每个位置上，A, T, C, G四个字母堆叠起来的总高度代表该位点的保守程度或信息量。总高度越高，说明这个位置越重要，碱基选择“挑剔”。

2. 单个字母的“大小”：

○ 在每个位置上，字母本身的大小与该碱基在此位置出现的频率成正比。字母越大，说明这个碱基在此处越常见。

○ 例如： 如果在某个位置只有一个巨大的“A”，其他三个字母很小，说明几乎所有序列在这个位置都是A，此处高度保守。

3. 整体模式：

○ 观察整个序列模式，它代表了结合蛋白偏好的“序列指纹”。

○ 例如，一个锌指蛋白的Motif可能呈现特定的模式，而一个碱性亮氨酸拉链蛋白的Motif则可能是另一种模式。

一句话解读：看哪个碱基在每个位置上“最大”、最突出，整个堆叠起来的高序列模式就是推测出的转录因子“结合密码”。

 

数据格式

FASTQ、SAM、BAM

 

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FASTQ格式
存储原始测序数据，包含序列与质量分数，是后续比对与分析的基础。
 
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SAM/BAM格式
存储比对结果：

● SAM为文本格式，可读性强；

● BAM为二进制格式，压缩存储，便于传输与分析。

 
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