通过对⾎液、组织或细胞样本进行ONT全基因组重测序，不仅可以分析CNV、SV、SNP和结构变异等，还可以在单碱基水平检测DNA各类修饰。
技术简介
全基因组重测序（Resequencing） 是对具备已知参考基因组序列的物种个体进行基因组测序，通过与参考序列比对，分析个体或群体间的基因组差异。该技术能够高效、全面地检测基因组中的多种变异类型，包括：单核苷酸多态性（SNP）、拷贝数变异（CNV）、插入/缺失（InDel）、结构变异（SV）。凭借其强大的变异检测能力，全基因组重测序已广泛应用于临床医药研究、群体遗传学、关联分析、进化分析等多个领域。
二代测序（NGS）短读长（≤300 bp）难以解析重复序列和复杂结构变异，PCR扩增偏差影响拷贝数变异（CNV）等检测灵敏度。三代测序（LRS）凭借超长读长精准解决复杂区域，无PCR偏差提升覆盖均匀性，且高准确性（>99%）支持临床级应用，在结构变异、单倍型分型等方面优势显著。
ONT全基因组重测序（ONT-lrWGRS）是利用牛津纳米孔技术（ONT）对基因组DNA进行直接测序的方法。其核心优势在于超长读长，能有效跨越复杂重复区域和解析结构变异，同时可检测碱基修饰（如甲基化），适用于基因组组装、结构变异鉴定和表观遗传学研究，具有实时、快速的特点。
技术优势
✔ 高变异检出率：无需PCR扩增，无GC偏好，超长读长，轻松跨过高重复和高复杂度区域。
✔ 精确的变异信息：超长读长，为检测检测SV大结构变异提供保障。
✔ 更丰富的分析内容：除变异信息之外，还能检测DNA上的各种碱基修饰。
实验步骤及流程图
1. 文库构建原理
图1：ONT全基因组重测序文库构建流程图
首先提取高质量的基因组DNA样本，对DNA样本进行打断（可选）。接着对DNA样本进行末端修复和加A，连接样本Barcode，连接测序接头。加载到测序芯片上进行测序。
2. 技术路线
送样要求
• 提取的DNA样本：总量≥5 ug，浓度≥200 ng/uL，纯度：260/280 ≥1.8、细胞样本：≥1×107cells
• 新鲜或冻存的动物组织样本：≥200 mg
• 新鲜或冻存的植物组织样本：≥500 mg
• 全血：≥ 4 mL
案例应用
案例1
文献1: Structural variants in the Chinese population and their impact on phenotypes, diseases and population adaptation
中文标题：中国人群的结构变异及其对表型、疾病和群体适应的影响
期刊：Nature Communications
影响因子：14.7
样本：本研究共纳入405人（男性206人，女性199人），年龄从22岁到81岁不等
测序平台：Oxford Nanopore PromethION
作者基于ONT平台开展全基因组长读长测序，结合健康筛查获取327个个体的68项表型与临床测量值，构建了包含基因组测序数据与表型/临床数据的综合数据库。数据经质控后，将干净读长比对至参考基因组GRCh38，检测出长度≥50bp的DEL（缺失）、INS（插入）、DUP（重复）和INV（倒位）四类结构变异（SV）。
为提升SV可靠性，采用Sniffles、NanoVar和NanoSV三种长读长测序分型方法交叉验证，仅保留被至少两种方法识别的SV，有效降低假阳性率。结果显示，平均每个样本鉴定出18,489个高置信度SV，数量近似正态分布，以DEL和INS为主。进一步分析发现，当测序深度超过15倍时，SV数量增长趋于饱和，表明深度与SV检出率间存在非线性关联。研究结果为基因结构变异特征分析提供了定量依据，并揭示了测序深度对SV检测效率的影响规律。
为解析结构变异（SV）的潜在功能，作者基于基因组位置对SV进行注释，覆盖编码区（CDS）、非翻译区（UTR）、启动子及内含子区域。结果显示，内含子区SV占比最高，而UTR和CDS区的SV中，单例SV（仅在单个样本中检测到）显著富集，提示其潜在功能倾向性。针对与CDS重叠的SV，依据断点位置进一步划分为三个亚型：预测功能丧失型（pLoF）：导致编码核苷酸缺失或开放阅读框改变；全基因复制型（WDUP）：引发基因整体拷贝数增加；全基因倒位型（WINV）：通过重组上游增强子与基因位置/方向调控表达。功能注释发现，受pLoF SV影响的38个基因在“免疫球蛋白受体结合”通路显著富集，暗示其在免疫调控中的潜在作用。
为了更好地理解pLoF SV如何影响临床表型和疾病，作者使用GWAS catalog,OMIM和COSMIC数据库注释了SV及其相关基因。例如，一个19.3 kb的杂合罕见DEL，覆盖了血红蛋白亚基α 1和2（HBA 1和HBA 2），其功能障碍会导致α-地中海贫血; 27.4kb的杂合DEL，其含有血红蛋白亚基β（HBB），其功能障碍会引起严重的血红蛋白病，例如镰状细胞贫血和β-地中海贫血。另外，在gnomAD 数据库中发现19.3kb的DEL序列，其中92.3%来自东亚群体，这表明该DEL序列具有群体特异性。最后进一步基于次要等位基因频率（MAF）> 0.05的基因分型SV进行了临床表型的GWAS，例如生化、血液和尿液组成，还探讨了中国北方和南方群体之间的群体遗传特性的基础上DEL和INS。PCA显示两组之间存在明显的遗传多样性；华南、华北和华南与华北之间个体的平均IBS距离较小，表明亚群之间的差异很小。
虽然之前使用SNP阵列和基于SRS的WGS已经揭示了中国北方和南方个体之间的遗传差异，但本文作者使用FST和PBS分别在中国北方和南方人群的基因组中观察到24个和35个独立的PBS信号。在中国北方人群中，前两个信号位于主要组织相容性复合体（MHC）区域（6p21.3-p22.1）和免疫球蛋白重链（IGH）簇基因座（14q32.33）。在MHC区域中，具有PBS信号的九个SV位于HLA-G、HLA-A、HLA-DRA、HLA-DRB 5、HLA-DRB 1、HLA-DQA 1和HLADPA 1的基因间区域。值得注意的是，有10个具有PBS信号的SV位于IGH簇基因座中，例如IGHG 3和TEDC 1、TMEM 121、IGHA 2、IGHE、IGHG 2、IGHA 1、IGHG 1和IGHG 3的基因间区,这表明IGH基因不同基因型的积累和组合可能与免疫适应不同环境有关。在中国南方人群中也检测到MHC和IGH区域的PBS信号。这一结果表明，免疫相关区域的SV可能是由于长期暴露于不同的环境而产生的。此外，具有1.4kb INS的PBS信号位于PNPLA 7的第13内含子中。先前基于RNA测序分析，PNPLA 7与高血压相关。而中国北方人口的血压和高血压患病率高于南方人口。但需要更多的证据来证实PNPLA 7内含子中的INS可以引起基因表达的变化，从而导致血压的变化。
案例2
文献2: Long-read sequencing identifies GGC repeat expansions in NOTCH2NLC associated with neuronal intranuclear inclusion disease
中文标题：长读测序鉴定与神经元核内包涵病相关的NOTCH2NLC中GGC重复扩增
期刊：Nature Genetics
影响因子：31.7
样本：8个家庭的13个患者和4例正常个体
测序平台：Oxford Nanopore PromethION
研究人员首先对家系1中的患病个体和正常个体进行了二代全基因组测序（WGS）或全外显子组测序（WES），并通过连锁分析将致病位点定位在1p36.31-p36.22 (chr 1: 6218354-9719813 [maximum LOD 2.32])约3.5-Mb 区域和1p22.1-q21.3 (chr 1: 94670784-152323132 [maximum LOD 4.21])约58.1-Mb区域内，但在二代WGS和WES测序数据中并没有发现致病性的SNPs或CNVs。
随后研究人员利用三代测序平台对来自8个家庭的13个患者和4例正常个体进行了全基因组测序，其中，除“F1-6”患者用PacBio RSII平台检测外，其余个体均用Oxford Nanopore PromethION平台进行检测。测序结果表明，13个患者在chr1:149390802-149390842处都有GGC重复扩增，该扩增序列位于NOTCH2NLC基因(NM_001364012)的5’UTR区域，定位在58.1-Mb的连锁区域内。对重复扩增区域进行进一步分析发现，除GGC重复单元外，重复序列中可能还包含GGA重复单元，这是由于在家系1、2和3患者的测序数据中都有reads支持GGA重复单元的存在，且F1-6的PacBio reads中也存在GGA重复单元。
NOTCH2NLC位于1q21.1，是人类特有的三个NOTCH2NL基因（NOTCH2NLA、NOTCH2NLB和NOTCH2NLC）之一，在包括神经胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞在内的多种神经细胞中高度表达，被认为参与了人类大脑皮层的进化。NOTCH2NL基因间具有高度的序列相似性，且多为GC-rich区域，因此难以用二代测序发等方法进行分析。而长读长测序技术，对于分析此类同源和重复区域具有很大优势。本研究还发现利用Nanopore PromethION 平台对NIID患者进行全基因组测序，即使在低覆盖度（～8X）下，也能检测到NOTCH2NLC基因中的重复扩张序列。
研究人员还利用Nanopore测序数据还分析了GGC重复扩张序列的甲基化水平，发现NOTCH2NLC的甲基化水平在GGC重复扩增区域与未扩增区域之间并无差异。因此认为由GGC扩增导致的CpG甲基化导致NOTCH2NLC功能丧失的可能性较小。
参考文献
1.Wu, Z., Jiang, Z., Li, T. et al. Structural variants in the Chinese population and their impact on phenotypes, diseases and population adaptation. Nat Commun 12, 6501 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-26856-x
2.Sone, J., Mitsuhashi, S., Fujita, A. et al. Long-read sequencing identifies GGC repeat expansions in NOTCH2NLC associated with neuronal intranuclear inclusion disease. Nat Genet 51, 1215–1221 (2019). https://doi.org/10.1038/s41588-019-0459-y
