ChIRP项目文章 | Nature子刊揭示lncRNA阻遏hnRNPK核输出抗肾损伤新机制

建立顺铂诱导（Cis-AKI）和缺血再灌注损伤（IRI）两种AKI小鼠模型，对肾脏组织进行高通量测序，筛选差异表达lncRNA；通过交集分析确定共同差异lncRNA，结合肾脏表达量和折叠变化筛选候选lncRNA；利用RT-qPCR验证表达变化，通过AnnoLnc2数据库和组织特异性检测分析RSDR的组织分布；通过CPAT、CPC、LGC等工具预测其编码潜力；采用FISH荧光共定位确定亚细胞定位。

关键发现：

两种模型中鉴定出87个共同差异表达lncRNA，其中XLOC_032768（命名为RSDR）在AKI中显著下调，且具有肾脏特异性表达；RSDR无蛋白编码潜力，主要定位于肾近端小管上皮细胞的细胞核，在三种损伤模型（顺铂、IRI、CLP）的肾脏组织和近端小管上皮细胞中表达均显著降低。

构建肾脏特异性RSDR敲入（KI）小鼠，建立三种AKI模型（顺铂、IRI、CLP），检测血清肌酐、尿素氮水平，通过组织学分析（H&E、KIM-1免疫组化、TUNEL染色）评估肾损伤；体外建立RSDR过表达（OE）和敲低（sh-RSDR）的肾小管上皮细胞系（TCMK-1），通过EdU染色、TUNEL检测、流式细胞术分析细胞增殖和死亡情况。。

关键发现：

KI小鼠在三种AKI模型中肾损伤显著减轻，血清肌酐和尿素氮水平降低，肾小管损伤评分、KIM-1表达及TUNEL阳性细胞比例下降；体外RSDR过表达可缓解顺铂、LPS和缺氧诱导的细胞毒性，促进细胞增殖，减少细胞死亡；敲低RSDR则加剧细胞损伤，证实其保护作用。

采用ChIRP-MS筛选RSDR结合蛋白，通过功能富集分析和蛋白评分筛选关键候选蛋白；利用RNA pull-down和RIP实验验证RSDR与hnRNPK的相互作用；通过荧光共定位和Western blot分析hnRNPK在细胞内的定位变化；通过截短片段实验确定RSDR与hnRNPK的结合区域及关键结构域。

关键发现：

hnRNPK是RSDR的直接结合蛋白，二者特异性相互作用；RSDR通过结合hnRNPK的KH3结构域，限制其核输出，维持其核内水平；顺铂刺激会导致hnRNPK核内减少、胞质增加，而RSDR过表达可逆转这一现象；RSDR的1–113nt和227–339nt区域是与hnRNPK结合的关键区域。

利用单细胞测序数据分析和荧光共定位确定hnRNPK在肾近端小管上皮细胞中的定位；构建近端小管上皮细胞特异性hnRNPK敲除（ΔhnRNPK）小鼠，通过AAV9介导RSDR过表达进行拯救实验；检测血清肌酐、尿素氮水平，结合组织学分析评估肾损伤；体外通过hnRNPK敲低和RSDR过表达实验，分析细胞死亡及RSDR稳定性。

关键发现：

hnRNPK主要定位于肾近端小管上皮细胞，敲除后加剧AKI损伤，而RSDR过表达可部分逆转损伤；体外hnRNPK敲低增加细胞死亡，RSDR过表达可缓解；hnRNPK通过稳定RSDR减少其降解，二者形成正反馈 loop，共同保护肾功能。

对RSDR过表达细胞进行RNA-seq和ChIRP-seq，结合hnRNPK CUT&RUN数据筛选共同调控的靶基因；通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光验证DHODH的表达；利用ChIP-qPCR和荧光素酶报告实验分析RSDR和hnRNPK对DHODH启动子的调控；检测DHODH启动子区域的组蛋白修饰（H3K27ac、H3K4me3）。

关键发现：

DHODH是RSDR和hnRNPK共同调控的靶基因，二者通过结合DHODH启动子区域（TSS附近）促进其转录；RSDR过表达增加H3K27ac和H3K4me3在DHODH启动子的富集，而hnRNPK敲除则减少这些修饰；RSDR对DHODH的转录激活依赖于H3K27ac和H3K4me3。

通过转录组测序和单细胞测序分析AKI中DHODH的表达变化；检测 ferroptosis 标志物（GPX4、PTGS2、铁离子、MDA、4-HNE）的水平；利用DHODH抑制剂（BQR）和 ferroptosis 抑制剂（Lip-1、Fer-1）进行功能验证；通过MitoPeDPP检测线粒体脂质过氧化水平，分析DHODH对CoQ/CoQH₂比值的影响。

关键发现：

AKI中DHODH表达显著降低，其缺失会加剧 ferroptosis；DHODH通过将CoQ还原为CoQH₂维持线粒体 redox 稳态，抑制脂质过氧化；DHODH过表达可减少线粒体脂质过氧化，而敲除则加剧 ferroptosis，且外源性补充CoQH₂类似物可部分拯救细胞。

检测RSDR过表达（KI）和hnRNPK敲除（ΔhnRNPK）小鼠中铁死亡标志物（4-HNE、MDA、铁离子、CoQ/CoQH₂比值）及DHODH、GPX4、PTGS2的表达；通过AAV9介导DHODH过表达进行拯救实验；利用DHODH抑制剂（BQR）和线粒体抗氧化剂（mitoQ）分析对铁死亡和肾损伤的影响。

关键发现：

RSDR过表达可恢复DHODH水平，降低 铁死亡标志物；hnRNPK敲除则进一步降低DHODH，加剧铁死亡；DHODH过表达可部分逆转ΔhnRNPK小鼠的损伤；mitoQ预处理可减轻AKI中的铁死亡和肾损伤，证实DHODH是RSDR-hnRNPK轴调控 铁死亡的关键下游效应因子。

收集69例AKI患者和84例非AKI对照者的尿液样本，通过RT-qPCR检测RSDR水平；分析RSDR与肾功能指标（Scr、BUN、eGFR）的相关性；采用ROC曲线和机器学习模型（逻辑回归、XGBoost等）评估RSDR的诊断价值。

关键发现：

AKI患者尿液RSDR水平显著低于对照组，且与Scr、BUN呈负相关，与eGFR呈正相关；ROC曲线显示其诊断AKI的AUC为0.7452，敏感性72.46%，特异性72.62%；逻辑回归模型结合RSDR等指标的AUC达0.864，提示RSDR可作为AKI的潜在诊断标志物。