技术简介

RNA结合蛋白调控RNA生命周期的各阶段，包括剪接、裂解、聚腺苷化、稳定、定位、编辑和翻译等。RBPs与RNA相互作用是转录组和蛋白质组调节的关键，其功能缺失导致机体紊乱，引发多种疾病。系统鉴定RBPs在细胞功能和疾病状态中的动态变化对研究者了解生理功能和疾病进展具有重要意义。

2009年加州大学圣地亚哥分校的Gene W. Yeo教授团队通过一种名为交联免疫沉淀结合高通量测序（CLIP-seq）的技术，成功地在人胚胎干细胞中构建了细胞类型特异性剪接调节因子FOX2的RNA图谱。CLIP-seq是一种强大的实验技术，它能够将特定的RNA分子与蛋白质复合物进行高特异性的结合，从而揭示出RNA分子在细胞内的功能和调控机制。

2016年3月28日，Nature methods发表了一篇名为”Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP(eCLIP)”的文章，介绍了一种新的CLIP技术—增强型CLIP(eCLIP)。由于逆转录通常在RNA-RBP交联位点终止，eCLIP在逆转录之后将ssDNA adapter连接到cDNA片段的3’端，利用逆转录引物和ssDNA adapter扩增获得测序文库。完整保留了那些在RNA-RBP交联位点终断的RNA分子，通过分析UV交联位点实现单碱基分辨率。此外，eCLIP方法还改进了使用大小匹配的Input（SMInput）作为阴性对照。eCLIP技术为深入研究RNA与蛋白质之间的相互作用提供了强有力的工具。

武汉瑞兴经过自主开发和优化了eCLIP中RNA的建库策略，提升了eCLIP中RNA两端接头的连接效率，简化了操作步骤，提高文库构建成功率。

产品优势

  • 高分辨率：达到单碱基分辨率；

  • 高信噪比：Input样本有效去除了系统产生的背景噪音；

  • 流程简单：优化建库步骤，提高成功率；

实验步骤及流程图

1)UV交联；

2) 裂解细胞；

3) RNA片段化；

4) 免疫共沉淀；

5) NuPAGE胶电泳；

6) RNA提取；

7) RNA建库。

ieCLIP-seq实验流程图

送样要求

案例解析

拓扑异构酶I（TOP1, Topoisomerase I）是一种能促使DNA放松并预防和消除转录过程中扭转应力（torsional stress）的重要酶类，然而，调节TOP1酶类活性背后的机制，目前研究人员并不清楚。近日，一篇发表在国际杂志Molecular Cell上题为“RNA interacts with topoisomerase I to adjust DNA topology”的研究报告。


来自美国西北大学等机构的科学家们通过通过将eCLIP测序技术与体外RNA结合试验相结合，研究人员发现，TOP1能与RNA结合，而且这些RNAs中的大部分都是mRNAs，其能携带蛋白质合成所需的遗传信息；接下来，研究人员通过研究更好地理解为何TOP1与RNA结合与其在放松DNA方面所发挥的重要作用有关，利用DNA超卷曲实验、单分子磁性镊子实验（single molecule magnetic tweezer assays）和先进的测序手段，研究人员分析了TOP1的催化活性以及其是如何支持DNA和RNA之间的相互作用的。

研究人员发现，RNA与TOP1的活性相反，但重要的是，RNA聚合酶II（一种能将DNA转录成为mRNA的多蛋白复合体）能激活转录过程。研究者Mannan Bhola表示，本文研究揭示了一种独特的机制，即RNA能调节TOP1所介导的DNA松弛，从而在调节基因转录过程中扮演重要角色；通过识别出TOP1能作为一种RNA结合蛋白，研究人员就为揭示转录期间RNA和DNA之间的相互作用提供了新的见解。TOP1在很多人类癌症中都会过度表达，从而就能在转录过程中帮助调节DNA的功能，并未开发新型癌症疗法提供一定的信

参考文献

【1】Yeo, G., Coufal, N., Liang, T. et al. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat Struct Mol Biol 16, 130–137 (2009). https://doi.org/10.1038/nsmb.1545.

【2】Van Nostrand, E., Pratt, G., Shishkin, A. et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nat Methods 13, 508–514 (2016). https://doi.org/10.1038/nmeth.3810.

【3】Bhola, Mannan, et al. “RNA interacts with topoisomerase I to adjust DNA topology.” Molecular Cell (2024).