技术简介

       1958年，DNA双螺旋结构发现者弗朗西斯·克里克提出“中心法则”，阐述了DNA、RNA与蛋白质间的信息流动。基因转录产生前体RNA，经过可变剪接形成多种转录本，这些转录本翻译成不同的蛋白质异构体。选择性剪接使基因能产生多种蛋白质异构体，它们在结构和功能上可能有显著差异，并在特定疾病、组织或发育阶段中特异性表达。研究者们在《Nature Reviews Drug Discovery》上讨论了蛋白质异构体在药物发现中的作用，以及如何利用它们增强药物特异性和治疗效果【1】。因此，研究前体RNA的选择性剪接调节机制，以及这些转录本如何翻译成蛋白质并发挥功能，对于开发以蛋白质异构体为中心的治疗方法至关重要。

       在人类基因组中，超过90%的基因会经历可变剪接，产生多种转录本。在短读长cDNA测序中，读段常比对到共有的外显子，难以确定来源。跨越外显子的接合点读段虽能提升分析精确度，但当转录异构体共享剪接位点时，效果受限。ONT-IrRNA-seq（Oxford Nanopore Technologies long-read RNA sequencing）能直接检测全长的isoform，捕捉独特转录本，消除或降低检测偏差，提高差异表达转录本分析的准确性。

图1 短读长和长读长测序区别 

产品优势

  • 完善基因注释：发现新的转录本和基因，获得全面的转录组图谱。
  • 差异分析：差异表达基因（DEG）、差异表达转录本(DET)、差异使用转录本(DTU)。
  • 基因结构分析：准确分析可变剪接(AS)、多聚腺苷酸化位点（APA），3’UTR长度。
  • 转录本分辩率：在转录本水平上解析基因表达的调控机制及其功能。

实验步骤及流程图

图2 实验流程图

       首先通过olig dT磁珠捕获获得含有polyA尾巴的RNA，接着使用olig dT+一段固定序列的引物逆转录合成cDNA第一链，然后把TSO序列通过链置换方式添加到cDNA 3’末端，使用引物PCR扩增形成双链cDNA，最后将双链cDNA末端进行修平和连接ONT测序接头形成测序文库。   

送样要求

详细信息请参考推文：送样规范 | 武汉瑞兴生物三代建库测序类相关产品送样取样建议

案例解析

案例1

       来自美国纽约哥伦比亚大学的研究团队通过长读长等位基因特异性分析来了解罕见和常见变异对转录组的遗传影响。该研究结果发表Nature上，文章题为“Transcriptome variation in human tissues revealed by long-read sequencing”。

       研究团队利用FLAIR31对转录组进行了量化，并识别出新的转录组。在注释转录组数量较高的基因中，发现了更多的新转录组。其中，87%的内含子保留事件为新发现，这表明尽管进行了poly（a）富集步骤，pre-mRNA仍然存在。另一方面，只有37%的外显子跳过事件是新发现的，这表明它们在现有的注释中得到了更好的表达。

       研究团队评估了利用创新的转录注释和来自长读长测序的AST数据来解释罕见变异的潜力。评估结果表明，造成最严重后果的变异占所有变异的0.75%，其中编码变异为16,435个。研究发现，与保留相同注释的变体相比，被重新分配至更严重后果的变体平均具有更高的CADD得分。重新分配为致病性变异的结果表明，该研究检测出了之前可能被遗漏的某些生物学和功能性变异。因此，研究团队重新注释了ClinVar变体，最终有9,582个变体被重新分配（占1.23%）。研究发现，那些不确定的良性或致病性临床意义且没有明确标准的变异被重新分配的比例最高（分别为4%和3.1%）。

案例2

       徐州医科大学的郑骏年、董东和苏州大学第一附属医院支巧明团队合作，在Genome Medicine上发表了题为“Long-read sequencing reveals the landscape of aberrant alternative splicing and novel therapeutic target in colorectal cancer”的文章。研究团队使用长读长测序和短读长测序平台对CRC中的AS事件进行系统全面分析，发现了数千个未加注释的剪接异构体，其中一些新的转录本与CRC患者的生存密切相关，拓宽了人们对CRC肿瘤发生的理解。此外，新发现的剪接异构体TIMP1Δ4-5在介导CRC进展中发挥着重要作用，可能是CRC的潜在治疗靶点。

                              文献详细解读请阅读推文：文献解读 | 三代测序揭示了结直肠癌异常选择性剪接的前景和新的治疗靶

参考文献

【1】 Kjer-Hansen, P., Phan, T.G. & Weatheritt, R.J. Protein isoform-centric therapeutics: expanding targets and increasing specificity. Nat Rev Drug Discov (2024). https://doi.org/10.1038/s41573-024-01025-z.

【2】Stark, R., Grzelak, M. & Hadfield, J. RNA sequencing: the teenage years. Nat Rev Genet 20, 631–656 (2019). https://doi.org/10.1038/s41576-019-0150-2.

【3】Glinos, D.A., Garborcauskas, G., Hoffman, P. et al. Transcriptome variation in human tissues revealed by long-read sequencing. Nature 608, 353–359 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05035-y .

【4】Sun, Q., Han, Y., He, J. et al. Long-read sequencing reveals the landscape of aberrant alternative splicing and novel therapeutic target in colorectal cancer. Genome Med 15, 76 (2023). https://doi.org/10.1186/s13073-023-01226-y