技术简介

SMART-seq（Switching mechanism at 5’ end of the RNAtranscript）是2012年开发的一种单细胞转录组测序技术，它的原理是通过在反转录过程中引入一个定制引物，将细胞内的RNA转录本进行全长合成，使得可以获得单细胞水平上更详细和全面的基因表达数据。

2013年，Nature Methods 杂志上报道了 SMART-seq2，该技术是经 SMART-seq 改进的一种测序方法，以提高单细胞RNA测序的效率和覆盖度。Smart-seq2的引物设计更加精确，可以更好地应对低质量RNA样本，并且在捕获基因表达信息时表现更为灵敏。

技术优势

  • 全长转录本测序：获取细胞基因完整转录本信息，准确了解单细胞基因表达谱。
  • 适用性广泛：适用于多种细胞类型和样本，包括低质量单细胞RNA。
  • 单细胞分辨率：具备高单细胞分辨率，能深度探索细胞异质性和亚型。
  • 低输入RNA样本： 对RNA输入量要求更低，适用于限制性细胞样本。

实验步骤及流程

       该技术通过设计 oligo（dT）VN Primer 作为逆转录引物，利用 MMLVRT 的模板转换活性，在 cDNA 的3’端添加一段接头序列，通过该接头序列进行反转录，生成 cDNA 第一条链。

       当逆转录酶到达mRNA 5’末端时，会连续在末端添加几个胞嘧啶（C）残基。然后添加 TSO 引物，退火后结合在第一条链的3’端与 poly(C) 突出杂交，合成第二条链。

       这样得到的 cDNA 经过 PCR 扩增，获得纳克级的 DNA，纯化后可用于测序。

送样要求

案例解析

案例1

2020年上海复旦大学华山医院、同济大学附属东方医院、美国Auburn University等单位的研究人员在《Clinical and Translational Medicine》期刊上，发表题为“Circulating tumor cell characterization of lung cancer brain metastases in the cerebrospinal fluid through single-cell transcriptome analysis”的文章。

研究人员建立了一种有效的脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）收集方法，从5例肺腺癌柔脑膜转移(LUAD-LM)患者和3例对照组中分离出单个脑脊液细胞。利用Smart-seq2技术对3792个细胞进行单细胞测序，对脑脊液细胞的基因表达情况进行了全面表征。过滤掉低质量细胞后，文章分析了207个正常脑脊液细胞，41个B细胞，41个T细胞。平均每个细胞检测到803个基因表达。聚类分析发现正常淋巴细胞在不同微环境下具有相似的表达谱。正常脑脊液样本未发现B细胞。

图1. 脑脊液循环肿瘤细胞(CFS-CTCs)的分离和正常脑脊液细胞的组成

案例2

2021年3月2日，北京大学张泽民教授团队在Genomics Proteomics Bioinformatics发表了题为Direct Comparative Analyses of 10x Genomics Chromium and Smart-seq2的研究论文。该研究使用Smart-seq2和10x Genomics Chromium两种单细胞转录组测序技术，对一名肝细胞癌 (HCC) 患者的肝癌 (LT) 及其癌旁 (NT) 组织和一名直肠癌并伴有肝转移的患者的直肠癌(PT) 和肝转移 (MT) 组织中流式分选出的CD45-细胞进行比较分析，从多个角度分析二者差异，为单细胞转录组测序技术的选择与应用提供了基础。

10x中dropout率高于Smart-seq2，以LT细胞中的HK基因为例10x中dropout率也高于Smart-seq2，表达水平较低的基因具有较高的dropout率。在10x中从较少数量的细胞中检测到丰度较低的基因，这些基因可能导致更高的噪音。作者还发现基因表达变异系数 (CV) 与dropout率相关（CV常用来来衡量某基因在某些样本的表达变化情况），其中具有较大CV的基因通常表达较低，尤其是对于10x来说，同时具有较大CV的基因也具有较高的dropout率。

图2 LT细胞的Dropout评估结果

参考文献

【1】Ruan, Haoyu, et al. “Circulating tumor cell characterization of lung cancer brain metastases in the cerebrospinal fluid through single‐cell transcriptome analysis.” Clinical and Translational Medicine 10.8 (2020): e246.

【2】Wang, Xiliang, et al. “Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and smart-seq2.” Genomics, Proteomics and Bioinformatics 19.2 (2021): 253-266.