01
技术简介
单细胞三代全长转录组测序（single-cell long-read isoform sequencing，也写作 scIso-Seq）把单细胞捕获与三代长读长测序接在一起：单细胞这一端用细胞条形码（Cell Barcode）记住 cDNA 来自哪个细胞、用分子标签（UMI）记住它来自哪一条原始转录本；三代这一端不打断 cDNA，直接读出从 5′ 帽到 3′ poly(A) 尾的完整序列。它把单细胞分辨率与全长转录本覆盖这两件事合到一起，用来回答传统测序难以捕捉的细胞功能多样性、转录调控机制与疾病相关变异。
传统单细胞测序（如 10x Genomics 3′ 或 5′ 端测序）只捕获转录本末端片段，会留下两个盲区：一是区分不了同一基因的不同剪接变体（选择性启动子、外显子跳跃），而这些异构体功能可能正好相反，比如促癌型与抑癌型；二是融合基因的全长结构难以精准组装。三代全长把这两块补上——直接读完整序列，剪接位点、UTR 变异、RNA 编辑事件都能定位到具体位置；同时每个细胞单独分析，不会因为群体平均而掩盖稀有细胞类型（如癌症干细胞、免疫应答细胞）。
再往上一层，全长数据给的是多层级调控信息：同一基因用不同启动子可以产生功能迥异的蛋白（如 p53 异构体的促凋亡与促存活），而单细胞水平的剪接因子活性分析能揭示细胞状态转换的分子开关（如胚胎发育中 Wnt 通路异构体的动态变化）。落到具体研究上，它可以解析肿瘤微环境中促转移的剪接变体（如 CD44v6 促进 EMT）与耐药相关的新融合亚型（如 BCR-ABL1）、直接检出剪接错误导致的隐性致病变异（如脊髓性肌萎缩症的 SMN1/2 外显子跳跃），也能通过 T 细胞受体（TCR）的全长多样性预测免疫检查点抑制剂的响应。
技术原理 本服务基于 10x Genomics 单细胞捕获平台 + Oxford Nanopore 长读长测序技术构建：既能解析单个细胞的基因表达全景，也能精准捕获 mRNA 的完整结构信息，把单细胞转录组分析从基因表达水平推进到转录本异构体层面。
02
技术优势
异构体
全面转录异构体分析
已知与未注释的异构体一起输出，剪接位点、UTR 变异、RNA 编辑事件都能定位到具体碱基，不用靠短读长去猜测和拼接。
融合基因
融合基因全景解析
跨断点的长读段直接给出融合基因的全长结构，同时找出耐药相关的新融合亚型，避免把融合误判成某个基因的高表达。
亚群
细胞亚群精细化分类
全长转录本参与细胞聚类，得到比单纯基因表达更细的细胞细分群，提高细胞类型注释的准确性。
剪接动态
可变剪切实时监控
逐细胞计算外显子保留比例，追踪分化、发育与扰动过程中的剪接动态变化，把控演变过程。
03
实验流程
从样本解离、单细胞捕获到全长 cDNA 建库与三代长读长测序，在一条流程里完成。
图 1 单细胞三代全长转录组测序流程
04
样本要求
| 样本类型 | 取样量与预处理 | 保存与运输 |
|---|
| 新鲜组织推荐 | ≥ 200 mg（穿刺样本建议 2 条以上；特殊组织见下方细则）；取样时避开坏死、钙化、硬化、纤维化部位，去除电刀焦黑组织，PBS / 生理盐水洗去血液与分泌物 | 放入加满预冷组织保存液（MACS Tissue Storage Solution，货号 130-100-008）的样本保存管中，完全浸没样本，封口膜密封、泡沫纸 / 棉花缠裹，禁止样本直接接触冰袋，泡沫盒 + 2~3 个 −20℃ 预冷生物冰袋 4 ℃ 运输，顺丰 48 h 内可达优先，超 48 h 建议高铁快送；无法立即寄送时，将组织转入冻存管液氮速冻（或 −80 ℃）保存，干冰运输 |
| 细胞悬液 | 浓度 700–1,200 个/μL，总量 10 万以上；活性 > 90%、结团率 < 10%、有核率 > 70%、直径 5–40 μm | 低吸附无 RNA 酶管，冰袋湿冰运输（参考血液类） |
| 血液 / 骨髓 | 人全血 4–6 mL、小鼠 ≥ 1 mL（其他物种 1–5 mL）；骨髓血 4–6 mL、骨髓组织 ≥ 200 mg | 紫头 EDTA 抗凝管，冰袋（2–8 ℃）湿冰运输，24 h 内送达（默认提取 PBMC，48 h 内寄送仍可处理，骨髓组织运输同新鲜实体组织，冲出的骨髓细胞按悬液样本同血液寄送；24 h 后中性粒细胞偏高风险增加） |
| 冻存组织 / 冻存细胞 | 冻存组织 ≥ 200 mg；冻存细胞活细胞 ≥ 1×10⁶ | 冻存组织液氮速冻后 −80 ℃ 保存，干冰运输，建议使用冻存 1 个月内样本，需通过 total RNA 质检（RIN > 7）；冻存细胞干冰运输，送样后一个月内处理 |
| 运输与登记要求 |
| 温度与时效 | 新鲜样本 4 ℃（湿冰 / −20℃ 预冷生物冰袋），严禁样本直接接触冰袋导致组织凝固（凝固后活性严重下降）；冻存样本干冰运输，避免室温久置导致 RNA 降解 |
| 送样登记 | 送样前请提前填写《单细胞项目送样登记表》并准确填写建库类型信息；组织保存液务必加足，完全浸没样本并充满器皿，避免运输晃动产生气泡导致组织脱离保存液 |
建库原理 单细胞三代测序与二代测序共用同一套细胞捕获和 RT（反转录）流程：在 RT 产物阶段分为两份，一份用于二代建库、一份用于三代建库。因此样本准备要求与常规单细胞一致，不额外增加起始样本量。
* 取样与送样细节请对照《武汉瑞兴生物单细胞类相关产品送样取样建议》；送样前请与业务经理确认并索取《样本信息单》。
05
分析内容
标准分析 STANDARD
数据质控与去嵌合长读段质检、嵌合体去除、细胞与基因过滤
Isoform 鉴定与定量全长读段比对，已知与未注释异构体一并输出
细胞类型聚类Mark 基因聚类 + Mark 转录本聚类，两种策略互相比对
差异表达分析亚群间 / 组间差异基因
功能富集GO / KEGG / GSEA
高级分析 ADVANCED
可变剪接事件解析外显子跳跃 SE、可变 5′/3′ 位点 A5/A3、内含子保留 RI、互斥外显子 MX
外显子保留比例（PSI）逐细胞计算并比较亚群间的剪接差异
Isoform switch 分析异构体使用差异与生物型转换（蛋白编码 → 非编码）
融合基因分析跨断点长读段，输出融合结构
与 scRNA-seq 联合分析表达矩阵与剪接图谱来自同一批 cDNA，可直接比对
测试结果展示 样本：小鼠肺组织 ｜ 单细胞平台：10X 3′ v3 ｜ 三代平台：Oxford Nanopore
图 2 细胞类型聚类（Mark 基因聚类 / Mark 转录本聚类）
图 3 可变剪接分析（亚群间剪接事件差异）
图 4 融合基因分析（跨断点全长读段）
* 上图为该平台组合（10X 3′ v3 + Oxford Nanopore）的实测数据展示，具体图表以项目交付报告为准。
06
应用案例
Nature
Neuroscience
IF 20.3
文献案例 · 2024 · 小鼠 5 个脑区 × 4 个发育阶段 + 6 份人脑样本
基于单细胞长读长测序的图谱揭示发育中和成年小鼠与人脑中的特化剪接模式
Single-cell long-read sequencing-based mapping reveals specialized splicing patterns in developing and adult mouse and human brain
- 样本设计小鼠 5 个脑区（海马体、视觉皮层、纹状体、丘脑、小脑）× 4 个发育阶段（P14 / P21 / P28 / P56），另取 6 份健康人脑样本（含海马体，三男三女），行单细胞长读长转录组测序
- 研究背景脑组织细胞类型高度多样，同一基因常经可变剪接产生多种异构体；传统 3' 短读长单细胞测序只能读到转录本末端，难以判断单个细胞表达的究竟是哪个异构体，单细胞分辨率下的脑组织全长异构体图谱此前一直缺失
研究发现
- 72% 的基因至少在细胞亚型 / 脑区 / 发育阶段其中一个维度上存在全长异构体表达差异
- 青春期 P21–P28 是脑组织剪接变异性的关键过渡窗口
- 20% 的极可变外显子受 RBP 调控、16% 关联 sQTL
阅读原文 doi: 10.1038/s41593-024-01616-4 →
Science
Advances
IF 13.9
2026 · 武汉大学贾荣教授团队 · 瑞兴生物提供单细胞与单细胞三代测序支持
SRSF3 决定 Treg 在抗肿瘤免疫与自身免疫中的双重角色
SRSF3 determines Treg cell fate in antitumor immunity and autoimmunity
- 我司支持单细胞转录组测序（DNBelab C）+ 单细胞三代全长转录组测序（Oxford Nanopore）
- 样本设计人源化小鼠（Foxp3-Hu）MC38 结肠癌模型；Treg 特异性 Srsf3 敲除小鼠（Srsf3-cKO）；口腔鳞癌 5 例 + 乳腺癌 8 例患者肿瘤及癌旁组织。单细胞三代测序把 Treg 按 SRSF3 表达量分成高（前 25%）/ 低（后 25%）两组比较
- 研究背景FOXP3 是 Treg 的主转录因子，其外显子 2 可被跳过，产生全长型 FOXP3FL 与缺失型 FOXP3Δ2；外显子 2 对 Treg 的抑制功能至关重要，但调控这段剪接的关键因子一直不清楚
- 研究发现SRSF3 通过结合外显子 2 内的 ESE 增强子促进外显子 2 保留，同时在翻译层面促进全长 FOXP3 蛋白表达；单细胞三代测序在 SRSF3 高 / 低组间鉴定出 660 个差异表达基因与 145 个显著变化的剪接事件（覆盖 SE / A5 / A3 / RI）；Treg 特异性敲除 Srsf3 的小鼠 3–5 周内全部死亡，出现多器官致死性自身免疫炎症
- 660 个差异表达基因
- 145 个显著变化的剪接事件
- SRSF3 高表达与多种癌症不良预后相关
阅读原文 doi: 10.1126/sciadv.aeh1671 →
查看更多单细胞与三代测序案例 →
07
常见问题
已经做过短读长单细胞，还能补做三代吗？
可以。单细胞三代与二代共用同一套细胞捕获和反转录流程，在 RT 产物阶段分两份，一份做二代、一份做三代，所以不额外增加起始样本量。当时预留、保存在 −20 ℃ 的 cDNA 可以直接拿来建三代文库，不用重新解离样本；如果是干冰寄回的原管 cDNA，请先把保存情况告诉技术顾问。没有留存 cDNA 的话，需要重新取样。
短读长单细胞和单细胞三代，到底该选哪个？
关心「组织里有哪些细胞、各占多少、基因表达量怎么变」，短读长就够；关心「同一个基因用的是哪一个异构体、外显子保留还是被跳过、有没有融合」，需要三代。两者不是替代关系——同一批 cDNA 拆成两份，表达图谱和剪接图谱来自同一群细胞，可以互相印证。
一个样本要测多少个细胞？
常规项目 1,000–10,000 个细胞 / 样本。三代的数据量按细胞数摊薄，单细胞层面的定量精度低于短读长，所以更稳妥的做法是：用短读长拿到细胞数和高精度表达量，用三代在同源细胞群里解析异构体与剪接，两者联合来看。具体细胞数与数据量由技术顾问按样本和研究目标给出。
冻存组织、难解离组织能做吗？
可以走单细胞核方案（snRNA-seq + 长读长）。脑、心肌、脂肪等难解离组织，以及已经冻存的组织，用抽核的方式能拿到更完整的核内转录本，已有研究用这套组合解析阿尔茨海默病人前额叶皮层的剪接变化。请提前与技术顾问确认组织类型。
项目周期一般多长？
样本合格后，全长 cDNA 扩增与三代建库测序约 3–4 周，标准分析约 1–2 周；高级分析（融合基因、异构体开关等）按需求另行约定。周期受三代平台排机影响，具体以合同约定为准。
