技术简介
空间蛋白转录组 Stereo-CITE，在同一张组织切片上以单细胞分辨率实现全转录组和超高重蛋白共检测，是从"组织到数据"的空间多组学整体解决方案。该方案适用于人和小鼠新鲜冰冻（Fresh Frozen, FF）样本。
方案用 DAPI 染料对新鲜冷冻样本的 DNA 高效染色、精确定位细胞核结构；同时利用 Stereo-seq 芯片上装载的、带空间坐标信息的捕获探针，在同一张切片上原位捕获组织中的 mRNA 分子和抗体衍生标签（Antibody Derived Tag，ADT），再通过空间条形码（Coordinate ID，CID）还原回空间位置，生成基因和蛋白两张空间表达图谱。搭配多组学联合分析工具，可在单细胞分辨率、厘米级全景视场下同时获取转录组与多蛋白的空间分布信息，帮助量化组织异质性及其生物学意义。
技术原理
Stereo-seq 芯片上布满数十亿规则阵列排布的单链环状 DNA 纳米球（DNA NanoBall，DNB）。DNB 以单链环状 DNA 为模板、经滚环扩增（RCR）得到，每个 DNB 直径 220 nm，两个 DNB 中心点间距 500 nm。
携带空间条形码（CID）的 DNB 连接分子编码（Molecular ID，MID）和 PolyT 之后，既能捕获游离的 mRNA，也能捕获结合在蛋白抗体上的 ADT 分子。测序得到 CID 信息，而 CID 与 DNB 坐标位置一一对应——建立映射关系后，mRNA 与 ADT 的空间位置就同时被还原出来。这也是为什么蛋白和 RNA 能在同一张切片、同一套坐标体系下对齐。
技术优势
无偏空间原位多组学
可实现同一组织切片上 RNA 和蛋白质的无偏性共检测，且蛋白检测不影响转录组基因捕获——不是用蛋白"换"基因，而是两组信息叠加。
超高重数蛋白检测
高效检测超高重蛋白，检测重数与抗体组合在立项阶段确认。想看免疫分型就配免疫标志，想看肿瘤就配肿瘤相关标志，不必被固定 panel 绑住。
单细胞或亚细胞级分辨率
500 nm 分辨率，呈现空间微尺度分子景观——蛋白信号同样落在亚细胞尺度的坐标上，能看清标志物在细胞膜、胞质还是细胞间的分布差别。
基于测序的空间蛋白检测
蛋白以 ADT 的形式被"读"出来，因此无自发荧光干扰；也无多轮循环检测带来的抗原不稳定问题；更关键的是，蛋白检测重数的增加不影响检测时长——加抗体不等于加天数。
技术流程
组织制备
组织冷冻、OCT 包埋与切片，贴附到时空芯片
封闭与抗体孵育
切片固定后用封闭试剂封闭，依次孵育一抗与二抗
染色成像
二抗孵育完成后，用 DAPI 染色并显微拍照定位细胞核
组织固定与透化
清洗、固定与透化后，带坐标与 PolyT 的探针原位捕获 mRNA 与 ADT
文库构建
cDNA 与 ADT 分别释放扩增，获得时空测序文库
测序分析
DNBSEQ 测序后，经时空云平台或本地工具做可视化挖掘
样本要求
| 项目 | 要求 | 说明 |
|---|---|---|
| 样本类型限 FF | 人和小鼠的新鲜冰冻（Fresh Frozen, FF）OCT 包埋组织块 | Stereo-CITE 基于 Stereo-seq 芯片实现，样本前处理与 Stereo-seq FF 一致；石蜡样本不适用于本方案 |
| 取材时限 | 离体 30 分钟内完成 OCT 包埋 | 避免组织内部 RNA 降解；来不及包埋的可用组织保存液运输，需提前与技术顾问沟通 |
| 切面尺寸 | 组织切面 ≤ 芯片尺寸 ×0.9 | 10×10 mm 芯片 → ≤9×9 mm；5×5 mm 芯片 → ≤4.5×4.5 mm |
| 包埋块厚度 | Z 轴（厚度）控制在 2 cm 以内 | 厚度直接决定可切片数，也是质检 / 透化的消耗来源 |
| 组织用量 | 按切面与 RNA 丰度预留：单边 ≤1 mm 或 ≤3×3 mm 低丰度组织前处理总量 −1.5 mm；其余 −1 mm | 质检、透化各消耗 0.2–1 mm；CITE 流程在 FF 基础上多出封闭与抗体孵育步骤，建议多留余量 |
| 备份样本 | 尺寸大且无精细切面要求：≥1 个；尺寸小或全切：≥2 个 | 抗体组合一旦立项，样本量不足会直接导致无法补做 |
| 抗体组合 | 立项阶段确认目标蛋白清单，由技术顾问核对可及抗体与组合方案 | 可检测超高重蛋白，重数与抗体组合需提前确认；不是所有抗体都能同时上片，需提前排布 |
| 保存 | 两层锡箔纸包好 → 塑封袋封口 → −80 ℃，1 个月内实验 | 包埋块需水平冷冻（干冰上通常 5 min 内冻透），不推荐液氮或异戊烷–液氮浴速冻 |
| 运输 | 干冰运输，按 (N+0.5)×5 kg 备冰（N = 运输天数，24 h 计 N=1） | 到场须有干冰剩余、包埋块无融化无裸露；建议样本随包埋盒一同寄出，防止塑封袋冻裂 |
| 质检标准 | RIN（RQN）≥7；组织形态完整、无冰晶开裂 | RNA 质量不达标会同时影响转录组与蛋白两个维度的数据可用性 |
| 标记与资料 | 标注组织方向、组织位置、样本名称，切面标 "*" 或"切面"；提交《样本信息收集表》与包埋照片 | 无标记时默认底面为切面；标记不清导致切面错误需重新包埋。资料至少提前 1 个工作日发送 |
* Stereo-CITE 在 FF 前处理基础上增加封闭、抗体孵育与 DAPI 成像环节，抗体清单与组合方案请在立项阶段与技术顾问确认后写入项目方案。
实测案例
以人癌旁淋巴结为例，看 RNA 与蛋白联合之后，多了哪些单组学拿不到的信息。
分开不了的细胞群，联合之后能分开
多组学联合聚类可清晰区分单一组学难以区分的细胞类群：有些亚群在转录层面高度相似，靠表达谱分不开；加上表面蛋白信息之后，边界就出来了。
组织学结构能被准确还原
多组学联合聚类准确还原人癌旁淋巴结样本的组织学结构——分区边界和病理医生在切片上看到的一致，说明空间坐标没有错位。
RNA 与蛋白互相补充，聚类更准
RNA 与蛋白信息互相补充，联合分析可获得更精准的空间聚类。转录本水平的变化和蛋白水平的丰度并不总是一致——两个维度一起用，判断才稳。
蛋白组捕获区分癌症迁移区域
蛋白组捕获助力精准区分癌症迁移区域、刻画肿瘤免疫微环境；联合分析还帮助发现了 PD-L1 蛋白高表达的肿瘤相关 B 细胞特征性区域——这层信息只看转录本很难拿到。
应用方向
凡是"细胞是什么类型"和"上面挂了什么标志"需要一起回答的课题，都在这个方案的射程里。
肿瘤免疫微环境
免疫细胞浸润、免疫检查点（如 PD-L1）表达细胞的空间定位与共定位关系。
免疫细胞分型与组织分区
淋巴结、脾等免疫器官的分区结构与细胞亚群分布，亚群边界更清楚。
组织异质性
同一切片上细胞状态与蛋白表型的空间异质性，量化区域间差异。
标志物空间验证
把转录组发现的候选标志物落到蛋白与空间层面，为后续 IHC / 流式验证提供依据。
常见问题
和"先做空间转录组、再做 IHC"有什么区别？
蛋白检测会不会挤占基因捕获？
能检测哪些蛋白？可以自己指定吗？
为什么可以做到"加抗体不加时长"？
能用石蜡样本做 Stereo-CITE 吗？
项目周期一般多长？
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