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Oxford Nanopore · 三代测序

靶向全长转录组测序 ONT-TlrRNA-seq

全长转录组好，但要把人类转录组测到饱和，需要 30 Gb 以上的数据量，预算压力不小。可大多数课题真正关心的其实是几十到几百个基因。靶向路线的思路很直白：先用 PCR 把目标转录本的全长扩出来，再拿去测序——测序量全部花在你关心的基因上，低表达的 isoform 也能测到足够深度。

  • 只测目标基因
  • 低表达 isoform 可测
  • 测序量小、成本低
  • 天然全长不拼接
  • isoform 直接识别
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目标基因只测你关心的转录本，不测全转录组
≥2µg RNARNA 起送量；也可直接送 PCR 产物
数千至上万 bp单条 read 覆盖目标转录本全长
低表达可测测序量集中，稀有 isoform 也能覆盖
01

技术简介

二代转录组测序给不出一个基因多个转录本各自定量的结果。原因在方法本身：短 read 跨不过全长转录本，只能靠软件把短片段拼成转录本再估表达量——拼接可能出错、可能不完整，拿不到真正的完整转录本；同时不同基因的高度相似区会产生多比对，一个基因的几条 isoform 共享大部分外显子，短片段分不清来自哪一条，转录本层面甚至基因层面的定量都会出现偏倚。

Nanopore 三代全长测序不需要打断和拼接：一条 read 就能跨越全长转录本，多比对率低，一个基因多条全长转录本各自的表达信息可以直接得到。从二代转录组到三代全长转录组，是平台层面的更替，解决的正是二代解决不了的问题。

但三代有个新的成本问题：每条 read 长得多，同样的数据量下 reads 条数就少得多。对低表达转录本而言，要把它们测到能可靠定量的深度，就得堆极高的测序深度——人类转录组要做到饱和检测，需要超过 30 Gb 的数据量。这笔开销对多数课题来说都太重。

ONT-TlrRNA-seq（Oxford Nanopore Technologies Targeted Long-Read Sequencing）是应对这个矛盾的做法：先用 PCR 扩增感兴趣的转录本全长区域，再直接对扩增子测序。测序能力被集中投到目标转录本上，在目标区域拿到高覆盖度，而总测序量和实验工作量都降下来。它不需要对整个转录组做全面测序，研究者能把资源集中在与疾病或特定生物学过程直接相关的那批转录本上。

02

技术优势

测序长度数千至上万 bp，覆盖全长

一条 read 就能覆盖完整转录本，从 5′ 端到 3′ 端不中断。

无需拼接，天然全长

转录本结构来自实测分子，不是组装推测。拼接引入的假 isoform 在这里不会出现。

可直接识别转录本 isoform

同一个基因的不同 isoform 分别定量，含新 isoform 的识别。

精准定量，低表达转录本亦可检测

测序量集中在目标基因上，等效深度远高于全转录组方案，低丰度 isoform 也能测到足够 reads。

测序量低，性价比高

不用为不关心的基因付测序费。样本数量多、需要重复的项目尤其明显。

03

技术原理

思路分两步：先在实验台上富集，再上机测全长。

第一步用 PCR 把感兴趣的转录本全长区域扩出来。这一步同时做两件事：把目标分子在样本里的占比抬高，以及把非目标分子排除掉。设计引物时要保证扩增产物覆盖转录本全长——从 5′ 端到 3′ 端都扩到，后续才能读到完整结构，而不是只拿到中间一段。

第二步对扩增产物直接做纳米孔测序。因为测序对象已经是富集过的目标片段，同样的测序通量全部落在目标转录本上，等效深度比全转录组方案高出不止一个量级，低表达的 isoform 也因此有机会被测到。

这套方法还有一个副产品：灵活性。换一批目标基因只需换引物和实验方案，测序流程不变，适合"先小批量验证、再扩大样本量"的推进节奏。

04

实验流程

ONT 靶向全长转录组测序流程：目标转录本全长区域 PCR 扩增、扩增子纯化、纳米孔建库与测序、全长 isoform 分析
ONT-TlrRNA-seq 流程：全长扩增 → 扩增子建库 → 纳米孔测序 → isoform 定量
引物设计是这类项目的成败关键。扩增区域决定了你能看到什么：扩得太短看不全 isoform 结构，扩得不够特异会产生大量非目标产物、白白占掉测序通量。多外显子基因、高 GC 区域、存在假基因或同源基因的位点都需要单独设计策略。建议立项前把目标基因清单发来，由技术顾问做一轮引物可行性评估。
05

送样要求

如果你们已经自行完成了目标区域扩增，也可以直接送 PCR 产物。

样本类型ONT-TlrRNA-seq说明
RNA 总量≥2 µg不建议直接寄送 RNA，优先寄组织或细胞
RNA 纯度OD260/280 ≥1.8蛋白或酚残留会压低比值
RNA 完整性RIN ≥7.0要扩全长，降解样本扩不出完整产物
细胞≥1×10⁷ 个TRIzol 充分裂解后 −80 ℃ 保存，干冰运输
动物组织 · 心、脑、肾、肺≥50 mg新鲜组织块尽量 ≤0.5 cm；去除结缔组织与脂肪；预冷 1×PBS 或生理盐水洗去血迹，液氮速冻 1 h 后 −80 ℃ 保存，干冰运输
动物组织 · 肝、脾、胃≥20 mg
动物组织 · 皮肤、血管、软骨、骨等坚韧组织≥100 mg
植物组织≥500 mg选健康幼嫩组织，液氮速冻 20 min 以上，干冰运输
全血4 mL按血液样本常规采血管要求采集与运输
免疫细胞干体积 ≥20 µL一般 10 µL 细胞干体积对应约 1×10⁶ 个细胞
已扩增的 PCR 产物可选≥200 ng；纯度 OD260/280 1.7–1.9、OD260/230 2.0–2.2；条带大小经琼脂糖凝胶电泳与预期一致适用于已自行完成扩增的课题组；请同时提供引物序列与预期产物长度
06

分析内容

标准分析 STANDARD

  1. 数据质控与目标区域统计reads 质控、目标区域富集倍数与覆盖深度
  2. 全长 isoform 鉴定目标基因的已知 / 新转录本分类
  3. isoform 定量与差异分析转录本水平表达量、组间 DET 与 DTU
  4. 可变剪接分析目标基因的可变剪接事件与组间差异
  5. 序列变异检测目标区域内的 SNV、InDel 与剪接位点变异

高级分析 ADVANCED

  1. 融合转录本检测目标基因相关的融合伴侣与断点
  2. 环状 RNA 鉴定反向剪接位点（BSJ）识别与环状转录本结构解析
  3. 单倍型与等位基因分析目标基因等位特异性表达与单倍型结构
  4. 免疫组库全长重建BCR / TCR 全长 V(D)J 序列与克隆型分析
  5. 新 isoform 功能预测ORF 预测、蛋白结构域注释与编码潜力评估
07

应用案例

案例一
IF 23.1 Blood · 亚洲型 DEL 血型

Patients with Asian-type DEL can safely be transfused with RhD-positive blood

亚洲型 DEL 患者可以安全地输注 RhD 阳性血液

期刊：Blood（IF 23.1）　·　发表时间：2023 年
阅读原文：doi.org/10.1182/blood.2022018152

亚洲型 DEL 血型研究设计：多中心临床试验、全国回顾性研究与 Nanopore 三代测序检测 RHD 全长转录本三条证据链
三条证据：临床试验 + 回顾性研究 + 三代测序测全长转录本

研究背景："亚洲型" DEL 是一种极弱 D 表型，常规血清学方法容易把它判成 RhD 阴性，导致这类患者被当成"熊猫血"对待，血源紧张且需要注射抗 D 免疫球蛋白。本研究要回答的是一个临床问题：这类患者能否安全地输注 RhD 阳性血液。

三条证据：① 首次开展多中心临床试验，给"亚洲型" DEL 患者输注 RhD 阳性红细胞，长期随访显示能够安全输注且未出现抗-D 同种免疫。② 全国范围的回顾性研究证实，"亚洲型" DEL 孕妇怀有 RhD 阳性胎儿时不会发生抗-D 同种免疫，与 RhD 真阴性孕妇存在统计学差异；在已产生同种抗 D 的孕妇中也没有发现"亚洲型" DEL 血型个体。③ 在"亚洲型" DEL 个体的有核红细胞中，借助 Nanopore 三代测序首次检测出携带 1227A 突变的 RHD 基因全长转录本；体外实验证实其能够表达具有完整表位的 RhD 抗原，与 RhD 阳性红细胞抗原表位一致——这提示该类患者可能通过免疫耐受避免同种免疫。

意义：该结果为"亚洲型" DEL 患者常规输注 RhD 阳性血液的临床输血规范提供了依据，可缓解这类患者的血源供应困难；相关孕妇无需注射抗 D 免疫球蛋白，也不必频繁做孕期抗 D 同种免疫监测，能节省抗 D 免疫球蛋白这一珍贵血液制品和每年数千万元的注射与监测费用。日本、韩国、东南亚以及东亚移民较多的发达国家的同类人群也能从中受益。


案例二
IF 3.9 Funct Integr Genomics · circRNA

Discovery of circular transcripts of the human BCL2-like 12 (BCL2L12) apoptosis-related gene, using targeted nanopore sequencing, provides new insights into circular RNA biology

用靶向纳米孔测序发现人类 BCL2L12 凋亡相关基因的环状转录本，为环状 RNA 生物学提供新见解

期刊：Functional & Integrative Genomics（IF 3.9）　·　发表时间：2025 年
样本：7 种结直肠癌（CRC）细胞系
阅读原文：doi.org/10.1007/s10142-025-01578-1

基于靶向纳米孔测序发现的新型 BCL2L12 环状 RNA 在结直肠癌细胞系中的表达分析
CRC 细胞系中 BCL2L12 circRNA 的表达分析

方法与分析：研究人员针对 BCL2L12 的每个注释外显子设计了 2 对发散引物（引物方向朝外，只有环状模板才能被扩增），并做嵌套 PCR。把不同细胞系的 PCR 产物混合纯化后构建纳米孔测序文库，再用公开工具和自研算法做分析，形成了一套识别新型 circRNA 的流程。在 CRC 细胞系中共鉴定出 46 种 BCL2L12 circRNA，其中大部分是首次发现；这些 circRNA 覆盖了 BCL2L12 基因约一半的区域，与公共数据库已收录的 circRNA 只有少量重叠。部分 circRNA 由单个外显子构成，还有一些包含此前从未描述过的外显子，这些外显子在出现频率和覆盖度上都有独特特征。分析还显示，BCL2L12 circRNA 在 7 种 CRC 细胞系中的表达存在显著差异，不同细胞系里 circRNA 的外显子结构和内含子覆盖状况各不相同——外显子 4 和 5 出现频率较高，但在不同细胞系中的具体结构存在差别。

BCL2L12 环状 RNA 的反向剪接位点分析：40 种不同 BSJ、非规范剪接位点与 poly A 片段的发现
反向剪接位点分析与带 poly(A) 片段的 circRNA

结构发现：在 46 种 circRNA 中共观察到 40 种不同的反向剪接位点（BSJ）。大部分 circRNA 的反向剪接位点不符合规范，且多数情况下形成 BSJ 的前体 mRNA 区域具有高度序列相似性。研究还发现 2 种 circRNA（circ-BCL2L12-9 和 circ-BCL2L12-55）含有类似 mRNA poly(A) 尾的多聚腺苷酸片段——这一发现对"circRNA 没有 poly(A) 尾"的传统认知提出了挑战。

08

常见问题

目标基因选多少个合适？
没有固定上限，但有两个实际约束。一是引物工作量：每个目标基因的引物都要单独设计和验证，基因越多验证轮次越多。二是富集效率：目标区域越大，富集倍数越低，等效深度下降，靶向的意义也随之减弱。经验上，几十个基因能保持很好的富集效果；几百个基因仍可做，但要按优先级分组。建议先明确核心目标基因（10–30 个）保证深度，再考虑扩展清单。
它和全转录组长读长（lrRNA-seq）怎么选？
核心差别是看多少基因、看多深。全转录组方案覆盖所有基因，但要测到饱和需要 30 Gb 以上，成本高、低表达 isoform 覆盖不足。靶向方案只测目标基因，把测序量集中过去，低表达 isoform 和稀有剪接形式能测到足够深度，总成本低得多。要发现新基因、做全转录组注释 → 选全转录组；已经锁定候选基因、要在大样本量里精细比较 isoform → 选靶向。
PCR 扩增会不会带来偏差？
会，这是靶向路线固有的代价，也是它和全转录组方案的主要取舍。扩增效率因片段长度和 GC 含量而异，定量上会有偏好。缓解办法有三条：加 UMI 扣除扩增重复；控制扩增循环数降低偏好累积；用技术重复评估重复性。如果课题的结论高度依赖精确的相对定量，建议在方案设计阶段就和我们讨论这几点，必要时做正交验证。
能测融合基因和环状 RNA 吗？
能，而且长读长在这两类结构上比短读长清楚。融合基因需要一条 read 同时覆盖两个基因的连接点，长读长天然满足；环状 RNA 用发散引物扩增、再从全长 read 里直接读出反向剪接位点和完整外显子组成——案例二就是这条路线，一次鉴定出 46 种 BCL2L12 circRNA 和 40 种不同的反向剪接位点。有这两类需求请在立项时说明，引物设计会相应调整。
能测 RNA 修饰吗？
不能。本技术走的是PCR 扩增 + cDNA 测序路线，修饰信息在逆转录这一步就丢了。要测 m6A 等 RNA 修饰，需要走 ONT-DRS（直接 RNA 测序，不逆转录不扩增）。如果目标基因明确、样本量足够，也可以和我们讨论 DRS 的靶向富集方案。
可以直接送已经扩好的 PCR 产物吗？
可以。按送样规范要求：总量 ≥200 ng，纯度 OD260/280 在 1.7–1.9、OD260/230 在 2.0–2.2，琼脂糖凝胶电泳条带大小与预期一致（无引物二聚体、无非特异扩增）。请同时提供引物序列和预期产物长度，方便我们核对。产物建议低温运输，避免反复冻融。
项目周期多久？
目标基因确认、引物设计与验证约 2–3 周；样本与 RNA 质检合格后，扩增与建库测序约 3 周，标准分析约 2 周。目标基因数量多或引物需要多轮优化时，前期周期会相应延长。
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