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表观遗传组 · DNA 甲基化

BS-seq 全基因组甲基化测序

重亚硫酸氢盐测序（Bisulfite sequencing，BS-seq，也称 Bisulfite-seq 或 Methyl-Seq）是一种利用亚硫酸盐处理 DNA，在全基因组范围内以单碱基分辨率研究胞嘧啶甲基化状态的方法。原理说起来很干脆：亚硫酸盐能把未甲基化的 C 变成 U，已甲基化的 5mC 不动——测序后比对，凡是 C 变 T 的位置就是没甲基化。

  • 单碱基分辨率
  • 全基因组 5mC 图谱
  • CG / CHG / CHH 分背景
  • 与 RNA-seq 联合
  • 动植物真菌细菌均可
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DNA≥500 ng浓度 ≥5 ng/µL、OD260/280 1.8–2.0
单碱基分辨率每个胞嘧啶的甲基化状态逐一判定
三种序列背景CG、CHG、CHH 分别统计
个性化方案按研究领域定制分析与挖掘
01

技术简介

BS-seq 的原理在于：亚硫酸盐可使 DNA 上的胞嘧啶（C）转变成为尿嘧啶（U），同时已被甲基化的 5-甲基胞嘧啶则不受影响。如此一来，通过亚硫酸盐处理可以使研究人员获得 DNA 序列上的特定碱基改变，从而确定其甲基化情形。

在获得亚硫酸盐处理后的 DNA 序列信息后，许多分析方法可以通过读取序列信息并进行基因组比对，来获得 DNA 甲基化的信息。这类分析的目标在于区分由亚硫酸盐处理导致的单核苷酸多态性（胞嘧啶和胸腺嘧啶），以此来判断基因组 DNA 甲基化情况，并和生物学意义进行关联。

测序得到的每条 read 都是处理后的链，因此每一个胞嘧啶位点都可以单独判定甲基化状态——这是 BS-seq 相比酶切法、亲和富集法的核心优势：不依赖抗体或酶切偏好，直接读取每个位点。

02

技术优势

个性化研究方案

针对不同研究领域提供个性化方案，按物种、样本类型与研究目标调整实验与分析设计。

分析流程全备

分析流程全备，数据解读详细，后期数据挖掘可提供个性化分析，不只交一份表达矩阵。

研究思路丰富

发育过程中 DNA 甲基化修饰图谱及修饰位点变化；疾病和对照组甲基化修饰图谱及修饰位点差异；与 ChIP-seq、RNA-seq 等数据一起联合使用，揭示甲基化修饰位点的功能。

03

数据分析流程

BS-seq 数据分析流程
BS-seq 数据分析流程
04

样本要求

不建议直接寄送 DNA——组织或细胞由我方统一提取质检更可控，DNA 提取质量直接影响重亚硫酸盐转化效率。

样本类型送样量说明
DNA（自行提取）≥500 ngA260/A280 1.8–2.0、浓度 ≥5 ng/µL、总量 ≥100 ng；干冰或冰袋运输
细胞≥1×10⁶ 个（干体积 ≥5 µL）TRIzol 充分裂解后 −80 ℃ 保存
动物组织≥30 mg取新鲜组织，块尽量 ≤0.5 cm；液氮速冻后 −80 ℃ 保存，干冰运输
植物组织≥100 mg选健康幼嫩组织；70% 酒精冲洗表面后液氮速冻
真菌干体积 ≥10 µL孢子或菌丝体均可，提前沟通物种与培养条件
细菌干体积 ≥10 µL提供菌种信息与培养条件
全血≥500 µL紫头 EDTA 抗凝管采集，冰袋 2–8 ℃ 运输
两个关键点：① 重亚硫酸盐处理对 DNA 完整性敏感，严重降解的 DNA 转化后reads 过短、比对率下降，建议送组织或细胞由我方统一提取；② 若关注 5hmC（羟甲基胞嘧啶），标准重亚硫酸盐测序无法区分 5mC 与 5hmC，需提前说明并考虑配套方案。完整版要求以最新版《送样规范》为准。
05

实测数据

BS-seq 数据分析结果：每条染色体平均分成 300 等份后各区段平均甲基化水平
染色体水平甲基化：每条染色体平均分成 300 等份，计算落在每一等份中的平均甲基化水平
BS-seq 数据分析结果：基因上游 5000bp 至下游 5000bp 的平均甲基化水平
基因区域甲基化：−5 到 0 为基因上游 5000 bp，0 到 10 为基因区域（平均分为 100 等份），10–15 为下游 5000 bp
BS-seq 数据分析结果：CG、CHG 和 CHH 中甲基化 C 附近 9bp 序列特征分析
序列特征：对 CG、CHG 和 CHH 中甲基化 C 附近 9 bp 的序列特征进行分析
BS-seq 数据分析结果：基因组浏览器视图中甲基化 C 位点与基因结构
基因组视图：上方为基因信息（红色正向链、蓝色反向链），红色峰为甲基化 C 位点，高度代表甲基化片段个数；两轴分别代表该样品 CHG 与 CpG 甲基化情况
06

应用案例

案例一
IF 25.9 Cell Research · 肾癌

Loss of 5-hydroxymethylcytosine is linked to gene body hypermethylation in kidney cancer

5-羟甲基胞嘧啶的缺失与肾癌中的基因体高甲基化有关

期刊：Cell Research（IF 25.9，2024 JCR）　·　发表时间：2016 年（26(1): 103–118）
阅读原文：doi.org/10.1038/cr.2015.150

样本与方法：配对正常肾脏组织与肾脏肿瘤组织；BS-seq 结合 5hmC 检测。
研究发现：这项研究通过对正常肾脏组织和肾脏肿瘤组织进行 BS-seq，分析发现：与匹配的正常组织相比，肾脏肿瘤中没有发生全基因组范围 5mC 丢失，而 5hmC 在几乎所有肾脏肿瘤组织中全范围丢失。

肿瘤组织中的 5hmC 水平是肾癌的独立预后标志——5hmC 水平越低，总生存期越短。肿瘤中 5hmC 的丢失与高甲基化有关，特别是在基因区域。研究结果表明，5hmC 缺失通过重构 DNA 甲基化模式，既是一种预后标志物，也是肾癌的致癌事件。

07

常见问题

BS-seq 和 RRBS 怎么选？
RRBS（简化代表性重亚硫酸盐测序）只覆盖 CpG 密集区域（约 5–8% 基因组），数据量小、成本低，适合大样本量、只关注启动子区 CpG 岛的课题。BS-seq 做全基因组覆盖，能同时看到 CpG 稀疏区、基因体、增强子与重复元件，适合需要完整甲基化图谱的研究。若后续要与 RNA-seq、ChIP-seq 做精细联合分析，BS-seq 的数据完整性更好。
标准 BS-seq 能区分 5mC 和 5hmC 吗？
不能。常规重亚硫酸盐处理下 5mC 和 5hmC 都不被转化，测序读出来是一样的。若研究问题涉及 5hmC（如本案例），需要配套方法（如 oxBS-seq、TAB-seq 或 5hmC 抗体富集）。请在项目启动时明确是否关注 5hmC，我们据此调整方案。
需要多少生物学重复？
差异甲基化分析建议每组至少 3 个生物学重复。甲基化水平的生物学波动相对较小，但 DMR 的检出仍依赖重复样本的统计一致性；只做甲基化图谱描述时每组 2 个也可以启动。
DNA 可以自己提取后寄送吗？
可以，但不建议。重亚硫酸盐转化对 DNA 完整量和纯度都敏感，降解或含酚残留的 DNA 转化效率低、reads 短、比对率下降。按送样规范，DNA ≥500 ng、浓度 ≥5 ng/µL、OD260/280 1.8–2.0。确实自行提取时，请一并提供浓度、纯度与电泳或 2100 质检结果。
植物、微生物样本能做吗？
可以。植物组织 ≥100 mg，真菌与细菌干体积 ≥10 µL。植物甲基化涉及 CG、CHG、CHH 三种背景（动物主要是 CG），我们的分析流程对三种背景分别统计，可直接输出各背景的甲基化图谱与差异区域。
能和 RNA-seq、ChIP-seq 一起做吗？
这是最常见也最有价值的组合。甲基化变化解释"为什么基因被关掉"，RNA-seq 给出"基因表达有没有变"，ChIP-seq 给出"组蛋白修饰是什么状态"。三套数据联合能回答"甲基化变化是否伴随表达抑制与抑制性组蛋白标记增加"，是甲基化功能研究的标准配置。
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