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技术简介
2019 年 4 月 29 日，Henikoff 实验室在 Nature Communications 上公布了 CUT&Tag （Cleavage Under Targets and Tagmentation）。这一创新技术彻底改变了 ChIP-seq 实验的细胞量需求，使其从原先的 10,000 个大幅降低到了 60 个，甚至单个细胞 ，这无疑是对生物学研究领域的一次重大突破。
CUT&Tag 技术的出现，不仅极大地提高了实验的可行性和效率，更在传统 ChIP-seq 实验中存在的信噪比 （信号与噪声的比率）和数据重复性 等问题方面实现了质的飞跃。
CUT&Tag 技术是一种革新性的蛋白质-DNA 互作研究方法，无需交联、超声打断、末端修复和接头连接 等操作，因此具有所需样本量少、实验周期更快、信噪比高和可重复性好等优势，甚至可用于单细胞水平测序，尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学 等研究领域。CUT&Tag 有望将蛋白质-DNA 互作的研究变成一种类似 PCR 反应的常规操作，对基因调控、表观遗传等领域的研究具有革命性的意义。
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技术优势
起始量低
所需细胞数 100–100,000 个 ，甚至可以做单细胞水平研究。对早期胚胎、稀有细胞亚群、微量分选样本尤其关键。
流程简单
无需甲醛交联、超声打断、免疫共沉淀、末端补平、加 A 和接头——步骤少意味着操作时间短、失败环节少。
特异性强
更高的信噪比和更低的背景——Tn5 只在抗体结合的位置附近切割，未结合区域基本不被打断。
性价比高、重复性好
所需测序深度少，单位数据成本更低；实验重复结果一致性好，适合多样本平行比较与队列研究。
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技术流程
该技术不需要使用免疫共沉淀 ，而是通过针对靶蛋白的抗体和 Protein A 的介导，成功实现了 Tn5 酶（已与 Protein A 融合） 在切割 DNA 片段的同时，在序列两端添加测序接头。经 PCR 扩增后，可以直接生成用于高通量测序的文库。
该技术的核心步骤为"切割下目标并进行扩增 "（Cleavage Under Targets and Tagmentation），这一步骤以前所未有的精度和灵敏度，针对极少量细胞进行了基因组范围内的蛋白质-DNA 相互作用研究。使用 CUT&Tag 技术，可以大大降低细胞投入量以及操作时间，仅需一天即可获得高质量的高通量测序文库 。
3 二抗 / pA-Tn5 结合 Protein A-Tn5 融合酶经抗体介导定位到靶位点
4 Tagmentation Mg²⁺ 激活 Tn5，边切割 DNA 边加接头
CUT&Tag 原理：抗体定位 → pA-Tn5 切割加接头 → PCR 建库
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样本要求
活细胞活性是关键指标 ：冻存前活性 >90%，复苏后活性 >85%。
样本类型 送样量 说明
活细胞 ≥5×10⁵ 个 冻存前活性 >90%、复苏后活性 >85%；细胞悬液冰袋运输，参考血液类样本 抗体 10–15 µL CUT&Tag 级别，或 IF-IP / ChIP 级别抗体 新鲜动物组织解离 · 心、脑、肾、肺 ≥100 mg 新鲜组织取样后尽快解离；当天干冰运输到实验室当天处理。易存在坏死和钙化的组织建议先解离再提核，可去除部分杂质、降低上机堵芯片风险 新鲜动物组织解离 · 肝、脾、胃 ≥100 mg 新鲜动物组织解离 · 皮肤、血管、软骨、骨等坚韧组织 ≥200 mg 冻存动物组织抽核 · 心、脑、肾、肺 ≥100 mg 冻存组织需液氮速冻后 −80 ℃ 保存、干冰运输，一个月内处理；所有冻存样本均需提 RNA 质检是否降解 冻存动物组织抽核 · 肝、脾、胃 ≥100 mg 冻存动物组织抽核 · 皮肤、血管、软骨、骨等坚韧组织 ≥200 mg 植物组织 ≥0.5 g 选健康幼嫩组织；70% 酒精冲洗表面后液氮速冻，干冰运输
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分析内容
标准分析 STANDARD
原始数据处理fastqc 质控、trimmomatic 去接头与低质量碱基、MultiQC 汇总；Clean 数据统计含 Q20 / Q30 / Dup / GC
比对统计Bowtie2 比对，统计 total / unique / multiple mapped 与 rmdup 后 reads 数
酶切片段长度分布统计 Tn5 插入片段长度，看无核小体、单核小体、双核小体三个峰的占比
信号分布reads 在 TSS 上下游 3kb、基因本体上下游 3kb 的密度分布热图
样本关系PCA 主成分分析 + Pearson 相关性热图，组内 R² 需大于 0.8
Peak calling 与峰特征MACS2（qvalue < 0.05；转录因子用 narrow、组蛋白按 ENCODE 峰型）；峰数量、峰中心上下游 3kb 平均信号、峰长度分布
Peak 注释与组内重叠ChIPseeker 注释 promoter / exon / UTR / intron / distal intergenic 与距 TSS 距离；DiffBind 组内重叠
富集与 Motif启动子区（TSS ±3kb）峰基因做 GO 与 KEGG；HOMER 峰内 motif 富集
高级分析 ADVANCED
组间差异 Peak分组比较峰强度，鉴定处理特异的结合或修饰位点
与 RNA-seq 联合结合位点 × 表达量变化，判断调控方向
与 ATAC-seq 联合可及性 × 结合位点，区分有结合无开放的位点
多修饰整合多个组蛋白修饰或因子图谱叠加，拼调控状态
靶基因预测由峰到基因的映射关系推断候选靶基因
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应用案例
案例一
IF 29.0
Nature Genetics · 混合谱系白血病
Automated CUT&Tag profiling of chromatin heterogeneity in mixed-lineage leukemia
混合谱系白血病中染色质异质性的自动化 CUT&Tag 分析
期刊： Nature Genetics（IF 29.0，2024 JCR） · 发表时间： 2021 年阅读原文： doi.org/10.1038/s41588-021-00941-9
样本与方法： Steven Henikoff 团队建立了 AutoCUT&Tag 平台 ，可全自动分析不同细胞系和患者样本中的肿瘤融合蛋白、转录相关复合物和组蛋白修饰，改进了 CUT&Tag 染色质分析技术。
发现 KMT2A 肿瘤融合蛋白的特异性位点： 利用 AutoCUT&Tag 分析白血病样本中的组蛋白修饰，发现了具有二价染色质特征的 KMT2A 肿瘤融合蛋白位点。二价染色质与肿瘤内异质性相关： KMT2A 肿瘤融合结合位点的一个子集被二价（H3K4me3 和 H3K27me3）染色质标记，并且这些位点上的二价染色质特征与同一肿瘤细胞之间的异质性相关，表明混合谱系白血病细胞群体中基因表达的异质性源于染色质动力学。不同融合基因的转录辅助因子亲和力不同： 发现不同的融合基因对各种转录辅助因子表现出不同的亲和力，可作为预测癌症对不同治疗性化合物敏感性的工具。单细胞层面的靶基因筛选： 对 H3K4me3 和 H3K27me3 的单细胞 CUT&Tag 分析，筛选出一组在大多数 KMT2Ar 白血病中共享的基因，这些基因与肿瘤细胞的生长和分化密切相关；部分样本中这些靶基因缺失，导致肿瘤内活性和抑制性染色质标记变化最大。
该发现不仅有助于深入了解 KMT2A 融合蛋白在白血病中的作用，也为开发针对这种融合蛋白的靶向治疗提供了新思路。
案例二
IF 15.7
Nature Communications · 方法学
CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells
CUT&Tag：用于小样本和单细胞的高效表观基因组分析
期刊： Nature Communications（IF 15.7，2024 JCR） · 发表时间： 2019 年阅读原文： doi.org/10.1038/s41467-019-09982-5
研究发现： 这是 CUT&Tag 的方法学论文。作者用 Protein A-Tn5 融合酶替代传统 ChIP-seq 的免疫共沉淀路线，在抗体指引下直接切割靶蛋白附近的 DNA 并同时加上测序接头，省去交联、超声、末端修复与接头连接等全部步骤。实验显示该方法在低至数十个细胞 的起始量下仍能获得高质量表观基因组图谱，信噪比和数据重复性均优于常规 ChIP-seq，并可扩展到单细胞水平——这为早期胚胎发育、干细胞、稀有细胞亚群等样本受限的研究打开了新的可能。
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常见问题
CUT&Tag 和 ChIP-seq 怎么选？ 看样本量和问题层级。CUT&Tag 起始量低（60–100,000 个细胞）、无需交联超声、一天建库、信噪比高，适合样本受限、大队列平行比较、单细胞水平研究；ChIP-seq 是经典路线，抗体选择面更广、对某些难做的靶点经验更多，但需要交联和超声、细胞量需求高（10⁷ 量级）、背景相对高。样本量少或想快速出结果选 CUT&Tag。
抗体有什么要求？ 需要 CUT&Tag 级别，或 IF-IP / ChIP 级别抗体，10–15 µL 。CUT&Tag 不做交联，抗体识别的是天然状态下的靶蛋白，因此 IF 级别抗体往往也能用——这比 ChIP-seq（需识别交联后表位）更宽松。建议提供抗体说明书或已有 IF / IP 数据。
一定要新鲜活细胞吗？冻存组织可以吗？ 活细胞最佳，冻存前活性 >90%、复苏后活性 >85% 。组织样本分两条路线：新鲜组织当天干冰运输、当天处理；冻存组织走抽核路线，干冰运输、一个月内处理。所有冻存样本均需提 RNA 质检是否降解，若组织太小不够分两管做质检，客户需承担全部上机风险。
需要做 IgG 对照吗？ CUT&Tag 背景本身很低，常规项目可以不做 IgG 对照 （报价口径即按"不做 IgG"计算）。若靶点为表达量低或特异性存疑的转录因子，仍建议加一组 IgG 或无靶点细胞对照，用于评估非特异背景。
项目周期多久？ 按报价口径，CUT&Tag 不含重复（1 个实验组、不做 IgG，3 G/文库，共 3 G 测序量）为 8–10 周 ，含重复（2 个实验组、不做 IgG，3 G/文库，共 6 G）同为 8–10 周，均不含抗体。注意实验操作本身只需一天，周期主要花在文库质检、测序排期与数据分析上。
能同时做多个组蛋白修饰吗？ 可以，这正是 CUT&Tag 的优势场景。多样本平行、多抗体组合的成本很低，适合系统性描绘染色质状态。实践中常见的组合是 H3K4me3（激活启动子）+ H3K27me3（抑制标记）+ H3K27ac（活跃增强子）+ 靶转录因子，再配一组 ATAC-seq 看可及性，一整套调控元件图谱就出来了。
